巨噬细胞免疫调变信号:Raf-1,MAPK p44,MAPK p42和p38 MAPK的研究

为了了解巨噬细胞免疫调变机理,我们应用LPS和PMA处理小鼠抑制性巨噬细胞,观察到Ras下游信号分子Raf-1,分裂原激活蛋白激酶MAPK p44,MAPK p42和p38 MAPK均被活化,发现forskolin能增强p38 MAPK的活性,进一步提示PKC和PKA途径增强了p38 MAPK的磷酸化效应,为我们了解LPS如何激活p38 MAPK信号通路提供了一个新的机会。     

LPS和PMA诱导小鼠腹腔巨噬细胞的PKC-α和PKC-ε的激活与转位

利用免疫印迹技术及内源性底物磷酸化方法,我们研究了在巨噬细胞的信号传递中起重要作用的PKC同功酶的分布及其在免疫调变剂LPS的刺激下产生的激活和转位。在未激活的巨噬细胞中,PKC-β的含量高于PKC-α和ε,它和PKC-α的分布均是胞质中大于胞膜。以PMA为阳性对照,结果提示LPS介导的抑制性巨噬细胞兔疫调变机制中涉及到了PKC-α和PKC-ε从胞质到膜组份的转让而不是PKC-β(PKC-βⅠ或βⅡ)的转位。应用PKC-依赖的内源性底物磷酸化的分析,结果说明胞质中55 kDa和74 kDa蛋白质磷酸化条带的减弱和膜组份中的类似蛋白质(PMA与LPS的刺激有不同的反应)磷酸化强度的增加,与PKC的转位有着相同的时间梯度。这结果提示在LPS介导的免疫调变信号传递通路中,PKC-α和PKC-ε可能介导了信号的传导及放大。     

巨噬细胞免疫调变信号：Raf—1,MAPKp44,MAPKp42和p38MAPK的研究

为了了解巨噬细胞免疫调变机理,我们应用ＬＰＳ和ＰＭＡ处理小鼠抑制性巨噬细胞,观察到Ｒａｓ下游信号分子ＡＦ－１,分裂原激活蛋白激酶ＭＡＰＫｐ４４,ＭＡＰＫｐ４２和ｐ３８ＭＡＰＫ均被活化,发现ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ能增强ｐ３８ＭＡＰＫ的活性,进一步提示ＰＫＣ和ＰＡＫ途径增强了ｐ３８ＭＡＰＫ的磷酸化效应,为我们了解ＬＰＳ如何激活ｐ３８ＭＡＰＫ信号通路提供了一个新的机会／     

巨噬细胞免疫调变信号——PKA与PKC对MAPK信号通路的调节

以前的研究工作表明,细菌脂多糖（ＬＰＳ）可以调变抑制性巨噬细胞为增强Ｔ、Ｂ淋巴细胞及ＮＫ细胞活性,同时又能保持或增强其抗肿瘤效应。忆报道了在这一复杂的免疫调变过程中伴随有蛋白激酶Ｃ（ＰＫＣ）和促分裂原活化蛋白激酶（ＭＡＰＫ）信号转导通路的激活。为了探索免疫调变过程中其他信号对ＭＡＰＫ通路的影响,以ＬＰＳ调变小鼠腹腔抑制性巨噬细胞为模型,研究了ｃＡＭＰ／ＰＫＡ和佛波酯（ＰＭＡ）／ＰＫＣ信号对ＭＡＰＫ     

Immunomodulated signaling in macrophages: Studies on activation of Raf-1, MAPK, cPLA_2 and secretion of IL-12

Little is known about the mechanism and signal transduction by LPS-mediated immunomodulation of murine peritoneal macrophages. It is found that the signal molecules of the down-stream of Ras, Raf-1, MAPK p44, and MAPK p42 are phosphorylated, and cPLA2 is activated with a significant increase of the release of [ H3 ] AA by macrophages in response to LPS and PMA. Compared with the very recent finding that LPS and PMA trigger the activation and translocation of PKC-α and PKC-ε, these findings suggest that there is a connection between PKC signaling pathway and the Raf-1/MAPK pathway and that the activation of these main signaling events may be closely related to the secretion of IL-12 during LPS-induced modulation of macrophages.     

云芝糖肽在ROS、p3 8信号通路中对巨噬细胞Raw264.7的免疫调节作用

目的:探究云芝糖肽(PSP)对静息和脂多糖(LPS)过度刺激两种不同状态的巨噬细胞Raw264.7产生活性氧簇(ROS)及p38、p-p38的影响及其相关机制。方法:采用流式细胞术方法检测ROS的表达;Western blot方法检测MAPK信号通路中p38磷酸化及非磷酸化的相对表达量。结果:100g/ml PSP下调1g/ml LPS单独作用于巨噬细胞时ROS及p-p38的表达量;100g/mlPSP上调正常巨噬细胞p-p38的表达量;p38表达量基本不变。结论:PSP通过ROS,p38两条通路参与巨噬细胞的免疫调节作用。     

云芝糖肽在ROS、p38信号通路中对巨噬细胞Raw264．7的免疫调节作用

目的：探究云芝糖hk（PSP）对静息和脂多糖（LPS）过度刺激两种不同状态的巨噬细胞Raw264．7产生活性氧簇（ROS）TLp38、p-p38的影响及其相关机制。方法：采用流式细胞术方法检测ROS的表达;Westernblot方法检测MAPK信号通路中p38磷酸化及非磷酸化的相对表达量。结果：100g／mlPSP下调1g／ml LPS单独作用于巨噬细胞时ROS及p-p38的表达量;100g／mlPSP上调正常巨噬细胞p-p38的表达量;p38表达量基本不变。结论：PSP通过ROS,p38两条通路参与巨噬细胞的免疫调节作用。     

白细胞介素-1受体相关激酶-2的共价修饰与激酶活性的研究

白细胞介素-1受体相关激酶-2(IRAK2)是调节IL1和Toll样受体信号通路的一个关键性分子,目前对于共价修饰如何调节IRAK2的活性还所知甚少。当与IRAK1共转染时,IRAK2能被共价修饰,在SDS-PAGE分离中呈现出迁移率变慢的多条电泳带。在小鼠骨髓干细胞分化的巨噬细胞(BMMs)中,内源表达的IRAK2在TLR配体刺激下也呈现出类似的共价修饰。而且IRAK2的共价修饰具有磷酸酯酶敏感性,提示大部分为磷酸化修饰。通过体外磷酸激酶活性分析,发现巨噬细胞中表达的IRAK2能在LPS诱导下被激活,成为一个具有激酶活性的调节蛋白。进一步研究发现激酶灭活的IRAK2突变体不能重建IRAK2基因敲除巨噬细胞的功能。通过Western杂交和定量PCR分析,发现IRAK2的激酶活性是介导LPS诱导的信号通路和炎症因子表达所必须的。因此,在LPS诱导下,IRAK2可能被IRAK1进行磷酸化修饰而活化,从而介导下游的信号转导通路、诱导炎症因子的表达。     

UVB 诱导凋亡时MAPK 和Mst1/caspase-3 信号通路调节 H2B 磷酸化作用

凋亡是真核细胞执行的高度协调的程序性自杀机制. 细胞凋亡时, 组蛋白的修饰与核
内事件有关. 尤其H2B 被Mst1 激酶磷酸化后, 参与调节核内凋亡事件染色质凝聚作用. 本研究
发现, UVB诱导细胞凋亡时, H2B发生磷酸化作用, 并且受MAPK家族(ERK1/2, JNK1/2 和p38),
Mst1 和caspase-3 信号通路调控. UVB能够以时间依赖方式激活MAPK家族激酶, 进而介导H2B
磷酸化, 但是H2B 乙酰化作用不受影响. 分别阻断ERK1/2, JNK1/2 或p38 任何一种激酶, 均能
抑制H2B 磷酸化作用. 而且, UVB 也能激活caspase-3, 活化的caspase-3 激活下游Mst1. 受到激
活的Mst1 直接磷酸化H2B, 导致染色质凝聚. 但是caspase-3 和Mst1 信号通路被完全阻断时, 只
能部分抑制H2B 磷酸化作用, 同时MAPK 家族激酶的活化不受影响. 因此, 细胞在受到UVB
诱导发生凋亡时, MAPK 和caspase-3/Mst1 信号途径分别独立调节H2B 磷酸化和染色质凝聚
作用.     

木犀草素通过抑制p65 NF-κB、促进p85 PI3K调节微血管内皮细胞VCAM-1表达（英文）

通过抑制微血管内皮细胞血管细胞黏附分子(VCAM)-1的表达,木犀草素可阻遏中性粒细胞与微血管内皮细胞的黏附,起到抗炎作用.木犀草素调节VCAM-1表达与三条信号通路有关:丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、核因子kappa B(NF-κB)/IκB和磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/Akt通路.其中,MAPK和NF-κB/IκB通路参与VCAM-1正向调节,PI3K/Akt通路参与VCAM-1负向调节.本文研究了木犀草素对微血管内皮细胞该三条通路中的关键蛋白p38 MAPK、p65 NF-κB、p85 PI3K磷酸化.结果表明:木犀草素在反应的30 s和1 min促进p38 MAPK磷酸化,在30 s、1 min和5 min促进p85 PI3K磷酸化,而在30 s、1 min、5 min和30 min抑制p65 NF-κB磷酸化.阻抑p38 MAPK通路导致VCAM-1表达下调,而p38 MAPK抑制剂SB203580可通过抑制p38 MAPK磷酸化也下调VCAM-1,提示木犀草素对微血管内皮细胞VCAM-1的调节作用独立于p38 MAPK磷酸化.由此可知,木犀草素通过抑制p65 NF-κB磷酸化或促进p85 PI3K磷酸化调节微血管内皮细胞VCAM-1表达.本文为木犀草素抗炎作用的分子机制研究提供了新的线索.     

烫伤对小鼠腹腔巨噬细胞LPS/Toll信号通路的影响—— c-fos基因表达、AP-1和NF-κB的DNA结合活性及IL-12 p40基因表达的抑制

烫伤能够引起机体免疫系统功能的抑制, 其机制目前还不很清楚. 巨噬细胞在机体防御系统的调节中居重要地位, 因此研究烫伤对巨噬细胞的效应就显得非常必要. 转录因子AP-1和NF-κB是Toll样受体介导的信号通路中的重要成员, 对于多种参与免疫反应的基因尤其是细胞因子基因的诱导表达必不可少[1]. 应用小鼠烫伤模型, 研究了烫伤对于上述两个重要转录因子的效应. 发现烫伤后, 小鼠腹腔巨噬细胞中LPS介导的c-fos基因表达, AP-1和NF-κB的DNA结合活性及IL-12 p40基因表达均被显著地抑制. 这一结果提示, 巨噬细胞Toll信号通路的变化与烫伤引起的机体免疫功能紊乱密切相关.     

滋养细胞胞内双链DNA感受器通过MAPK/IκB信号介导炎性细胞因子分泌

目的:探究滋养细胞能否感受胞内双链DNA刺激及其对炎性因子分泌的影响,揭示胎盘的免疫识别和免疫屏障功能,探讨妊娠期感染所致不良妊娠结局的发病机制。方法:利用人工合成的双链DNA模拟物poly (dA:dT)转染人滋养细胞系HTR-8/SVneo,Real-Time PCR方法检测滋养细胞胞内双链DNA识别受体的表达水平;Western Blot检测滋养细胞MAPK和IκB信号的活化情况;ELISA检测HTR-8/SVneo细胞培养上清中IL-6、IL-8、MCP-1、CXCL10的分泌水平。结果:Real-Time PCR结果表明,HTR-8/SVneo能够感受胞内双链DNA刺激并上调包括IFI16、AIM2、DHX36、DHX9、LRRFIP1、KU70、ZBP1/DAI和DDX41在内的多种双链DNA感受器的m RNA表达水平;Western Blot实验结果表明,滋养细胞识别双链DNA后能够促进MAPK和IκB信号通路活化,转染90分钟后ERK、JNK、p38和IκBα的磷酸化水平最高,其后随着时间逐渐减弱;加入IκB、p38和JNK特异性抑制剂能够抑制poly(dA:dT)介导的IL-8、IL-6和CXCL10分泌,但其分泌不受ERK抑制剂的影响;MCP-1的分泌能够被p38和JNK抑制剂阻断,但p38和ERK抑制剂不影响其分泌。结论:人滋养细胞存在功能性胞内双链DNA识别机制,活化的DNA识别信号能够激活MAPK和IκB信号通路,并通过IκB、p38或JNK信号介导IL-8、IL-6、MCP-1及CXCL10等细胞因子和趋化因子的分泌。     

卵巢癌细胞与巨噬细胞共培养对B7-H1表达的影响及机制

为了探讨卵巢癌细胞与巨噬细胞共培养后对B7．H1表达的影响及其可能机制,利用佛波酯（PMA）诱导THP-1或外周血单核细胞分化为巨噬细胞后,与人卵巢癌细胞株SKOV3体外非接触共培乔24h,qRT-PCR、Western blot以及流式细胞术分别检测SKOV3与巨噬细胞B7-H1的表达：进一步利用NF-KB、JAK2／STAT3、p38MAPK信号通路的抑制剂作用于共培养体系,检测B7-H1表达的变化,以探讨其机制。结果显示,共培养24h后,SKOV37L巨噬细胞B7-H1mRNA和蛋白的表达较非共培养组均显著升高（P〈0．05）,而阻断NF-κB、JAK2／STAT3、p38MAPK信号通路后,B7-H1的上调均明显被抑制（P〈0．05）。SKOV3与巨噬细胞共培养后B7-H1的表达升高伊〈0．05）,其机制可能涉及到NF—κB、JAK2／STAT3、p38MAPK信号通路的激活。     

核糖体S6蛋白激酶p90rsk与卵母细胞减数分裂

丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号途径对减数分裂有重要调节作用,p90rsk是迄今研究最清楚的MAPK下游靶分子,介导MAPK途径在卵母细胞减数分裂中的多种功能,包括卵母细胞减数分裂的启动、MⅠ/MⅡ期转化和MⅡ期阻滞的维持等.p90rsk的磷酸化是MAPK激活的结果,而细胞退出减数分裂时,p90rsk的去磷酸化也发生在MAPK失活以后.介绍了在卵母细胞中p90rsk的研究进展.     

周围神经损伤中P2Y12受体-p38MAPK通路的研究进展

周围神经损伤是临床中常见的神经损伤之一,神经胶质细胞和信号通路转导在周围神经损伤和再生修复中发挥重要作用。小胶质细胞的活化与周围神经损伤导致的神经损伤及疼痛密切相关,小胶质细胞是周围神经损伤与修复的关键场所。脊髓背角的小胶质细胞可被嘌呤信号通路的P2Y_(12)受体活化,进而导致p38MAPK磷酸化,造成相关神经损伤及感觉功能障碍。以脊髓背角的小胶质细胞为靶点,从P2Y_(12)受体-p38MAPK通路的角度可揭示周围神经损伤的部分可能机制。探究从嘌呤信号通路与小胶质细胞活化的新角度,将神经损伤后的P2Y_(12)受体与p38MAPK的磷酸化表达联系为P2Y_(12)受体-p38MAPK通路,可为临床治疗周围神经损伤提供新的思路。本文就周围神经损伤中P2Y_(12)受体-p38MAPK通路的研究进展作一综述。     

木犀草素通过抑制p65 NF-κB、促进p85 PI3K调节微血管内皮细胞VCAM-1表达

通过抑制微血管内皮细胞血管细胞黏附分子(VCAM)-1的表达,木犀草素可阻遏中性粒细胞与微血管内皮细胞的黏附,起到抗炎作用。木犀草素调节VCAM-1表达与三条信号通路有关：丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、核因子kappa B (NF-κB)/IκB和磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/Akt通路。其中,MAPK和NF-κB/IκB通路参与VCAM-1正向调节,PI3K/Akt通路参与VCAM-1负向调节。本文研究了木犀草素对微血管内皮细胞该三条通路中的关键蛋白p38 MAPK、p65 NF-κB、p85 PI3K磷酸化。结果表明：木犀草素在反应的30s和1min促进p38 MAPK磷酸化,在30 s、1 min和5 min促进p85 PI3K磷酸化,而在30 s、1 min、5 min和30 min抑制p65 NF-κB磷酸化。阻抑p38 MAPK通路导致VCAM-1表达下调,而p38 MAPK抑制剂SB203580可通过抑制p38 MAPK磷酸化也下调VCAM-1,提示木犀草素对微血管内皮细胞VCAM-1的调节作用独立于p38 MAPK磷酸化。由此可知,木犀草素通过抑制p65 NF-κB磷酸化或促进p85 PI3K磷酸化调节微血管内皮细胞VCAM-1表达。本文为木犀草素抗炎作用的分子机制研究提供了新的线索。     

LPS和PMA诱导小鼠腹腔巨噬细胞的PKC—α和PKC—ε的激活与转位

利用免疫印迹技术及内源性底物磷酸化方法,我们研究了在巨噬细胞的信号传递中起重要作用的ＰＫＣ同功酶的分布及其在免疫调变剂ＬＰＳ的刺激下产生的激活和转位。在未激活的巨噬细胞中,ＰＫＣ－β捻量高于ＰＫＣ－α和ε,它和ＰＫＣ－α的分布均是胞质中大于胞膜。以ＰＭＡ为阳性对照,结果提示ＬＰＳ介导的抑制性巨噬细胞免疫调变机制中涉及到ＰＫＣ－α和ＰＫＣ－ε从胞质到膜组份的转位而不是ＰＫＣ－β（ＰＫＣ－βＩ或βⅡ）     

一氧化碳减轻脂多糖诱导的大鼠小肠损伤与p38 MAPK磷酸化水平的关系

目的：观察低浓度一氧化碳（CO）吸入和腹腔给予对脂多糖（LPS）诱导大鼠小肠损伤的作用及作用过程中丝裂原活化蛋白激酶p38（p38 MAPK）磷酸化水平的变化。方法：6组SD大鼠静脉注入5mg／kg体质量IPS或等容量生理盐水;1h后,对照及LPS注入组吸入室内空气,CO吸入及LPS注入＋CO吸入组吸入体积分数为2．5×10^-4CO．CO腹腔及LPS注入＋CO腹腔组腹腔通入体积分数为2．5×10^-4CO。观察1、3、6h后放血处死,取回盲部上小肠,酶联免疫吸附法测定血小板活化因子（PAV）及细胞间黏附分子-1（ICAM-1）水平;光镜观察组织形态学变化;蛋白印迹法测定p38 MAPK磷酸化水平。结果：LPS注入组PAF、ICAM-1及p38 MAPK磷酸化水平显著高于相应时间点的对照、CO吸入及CO腹腔组（P均〈0．01）;组内各时间点比较,差异无统计学意义。与相应时间点的LPS注入组比较,LPS注入＋CO吸入及LPS注入＋CP腹腔组的PAF和ICAM-1明显降低（P均〈0．05）,但p38 MAPK磷酸化水平进一步增高（P均〈0．05）;此两组间及两组内各时间点比较,差异无统计学意义。结论：低浓度CO吸入和腹腔给予以非时间依赖方式下调LPS诱导的大鼠小肠PAF、ICAM-1表达而起相似的保护作用;p38 MAPK信号转导通路可能参与了这一过程。     

电磁辐射对大鼠海马Raf／MEK／ERK信号通路的影响

目的：研究电磁辐射后大鼠海马Raf／MEK／ERK通路相关信号分子的表达变化规律。探讨辐射损伤机制。方法：分别采用X波段高功率微波（X-HPM）、S波段高功率微波（S-HPM）及电磁脉冲（EMP）模拟源辐射大鼠,建立电磁辐射动物模型。通过Western blot检测海马Raf-1、磷酸化Raf-1和磷酸化ERK的表达。结果：三种电磁辐射后6h-14d,Raf-1表达均下调,以7d最为显著,至28d基本恢复,辐射组间未见明显差异。辐射后6h和7d,磷酸化Raf-1和磷酸化ERK表达均上调,6h较为明显,磷酸化ERK的变化以两微波组更为显著。S-HPM辐射后6h～14d,磷酸化Raf-1表达持续上调,磷酸化ERK的变化呈波浪状,以6h和3d为高峰。结论：Raf／MEK／ERK信号通路参与了电磁辐射所致海马损伤;ERK通路过度活化导致神经元凋亡与坏死可能是电磁辐射致认知功能障碍的重要机制。