汉滩病毒M、S基因不同拼接方式在昆虫细胞中融合表达效果比较

将汉滩病毒囊膜糖蛋白G1与核蛋白(NP)部分片段以不同方式拼 接,构建G1S0.7或S0.7G1嵌合基因,分别插入杆状病毒表达载体pFBD,转化DH10Bac致敏菌, 获得含有嵌合基因的重组穿梭质粒Bacmid,用其转染Sf9细胞,快速筛选出含有G1S0.7或S0.7 G1嵌合 基因的重组杆状病毒,在昆虫细胞中表达外源融合蛋白.利用间接免疫荧光、ELISA和免疫 印迹对表达产物进行检测.结果表明,含G1S0.7嵌合基因之重组杆状病毒可在昆虫细胞中表 达出融合蛋白,该蛋白可被抗汉滩病毒核蛋白及糖蛋白G1特异性单抗所识别,其分子量约97 kD;含S0.7G1嵌合基因之重组杆状病毒在昆虫细胞中表达的融合蛋白,只能被抗汉滩病毒核 蛋白特异性单抗所识别,其分子量约43kD.上述结果提示,G1S0.7嵌合基因可能在昆虫细胞 中表达出完整的具有生物学活性的融合蛋白,S0.7G1嵌和基因的昆虫细胞表达产物不完整 ,且生物学活性不如G1S0.7嵌合基因的表达产物.     

重组人可溶性PDGFRβ/Fc在昆虫细胞Sf9中的表达

【目的】利用昆虫细胞Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达血小板源性生长因子受体β (PDGFRβ)链膜外区与人IgG Fc片段的可溶性受体融合蛋白sPDGFRβ/Fc,并检测重组蛋白的特异性和生物活性。【方法】采用Bac-to-Bac系统,构建重组转移质粒pFastbac-sPDGFRβ/Fc,转化到含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中,使目的基因与杆状病毒基因组DNA发生位点特异性重组,获得重组病毒DNA,将其通过脂质体转染昆虫细胞Sf9获得重组病毒。将该重组病毒感染Sf9无血清细胞系,在Sf9细胞中表达sPDGFRβ/Fc,对表达产物进行Western blotting检测和Protein A亲合层析纯化,并进一步通过MTT法检测获得的重组蛋白生物学活性。【结果】重组病毒感染Sf9细胞后,经Western blotting分析,能检测到一条分子量约为97 kDa的特异性条带,与目的蛋白大小相符。通过Protein A亲和层析,获得了纯度达75％以上,表达量为1 μg/mL细胞培养上清的重组融合蛋白,MTT结果显示该重组融合蛋白sPDGFRβ/Fc具有抑制PDGF刺激的Balb/c 3T3细胞增殖的能力。【结论】具有生物活性的重组可溶性受体融合蛋白sPDGFRβ/Fc可在昆虫细胞中成功地得到表达。     

汉滩病毒M、S基因不同拼接方式在昆虫细胞中融合表达效果比较

将汉滩病毒囊膜糖蛋白G1与核蛋白 (NP)部分片段以不同方式拼接 ,构建G1S0 .7或S0 .7G1嵌合基因 ,分别插入杆状病毒表达载体 pFBD ,转化DH10Bac致敏菌 ,获得含有嵌合基因的重组穿梭质粒Bacmid ,用其转染Sf9细胞 ,快速筛选出含有G1S0 .7或S0 .7G1嵌合基因的重组杆状病毒 ,在昆虫细胞中表达外源融合蛋白。利用间接免疫荧光、ELISA和免疫印迹对表达产物进行检测。结果表明 ,含G1S0 .7嵌合基因之重组杆状病毒可在昆虫细胞中表达出融合蛋白 ,该蛋白可被抗汉滩病毒核蛋白及糖蛋白G1特异性单抗所识别 ,其分子量约 97kD ;含S0 .7G1嵌合基因之重组杆状病毒在昆虫细胞中表达的融合蛋白 ,只能被抗汉滩病毒核蛋白特异性单抗所识别 ,其分子量约 4 3kD。上述结果提示 ,G1S0 .7嵌合基因可能在昆虫细胞中表达出完整的具有生物学活性的融合蛋白 ,S0 .7G1嵌和基因的昆虫细胞表达产物不完整 ,且生物学活性不如G1S0 .7嵌合基因的表达产物     

静水椎螺乙酰胆碱结合蛋白在Bac-to-Bac系统中的表达、纯化与结晶

表达、纯化静水椎螺(Lymnaea stagnalis)乙酰胆碱结合蛋白(Ls-AChBP)并得到晶体。将静水椎螺乙酰胆碱结合蛋白cDNA序列克隆到表达载体pFastBac1上,构建了重组表达质粒pFastBac1-Ls-AChBP-His,经重组子筛选,得到重组杆状病毒质粒Bacmid,采用CellfectinⅡ脂质体,把带有外源基因的杆状病毒质粒Bacmid转染到昆虫细胞中,经镍柱和凝胶色谱柱对重组蛋白进行纯化得到五聚体,并用机器人进行结晶筛选获得其蛋白晶体。重组蛋白Ls-AChBP在Bac-to-Bac表达系统中得到高效表达并被纯化,结晶筛选得到晶体。     

猪IL-18 在杆状病毒/昆虫细胞中的表达

IL-18作为一种多效性细胞因子,在机体免疫应答及各种生理功能中发挥着重要的调节作用,根据猪IL-18基因序列设计1对引物,将编码猪IL-18的成熟蛋白基因亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacDual中,并在C端融合6个组氨酸标签以利于纯化,然后转化到含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中,发生转座作用。将重组质粒转染昆虫细胞,SDS-PAGE可检测到分子量为18 kDa左右的重组蛋白,Western blotting证实该重组蛋白可与兔抗猪IL-18抗体发生特异性反应。纯化后蛋白能明显促进猪T淋巴细胞转化,表明所表达的IL-18具有较高的生物活性。此研究为进一步开发研制新型免疫佐剂奠定了基础。     

人细胞周期蛋白D1/CDK4基因的真核表达及生物活性鉴定

通过生物工程获得人重组细胞周期蛋白 (cyclinD1 )及细胞周期蛋白激酶CDK4蛋白 ,作为抗癌药物筛选的分子靶点 .从人HL 6 0细胞中获得细胞周期蛋白D1 CDK4基因的cDNA ,先克隆至pGEMT Easy载体上 ,再经重组构建供体质粒pFastBac D1和pFastBac CDK4 .重组供体质粒转化感受态DH1 0Bac细胞 ,挑取确证为白色克隆的菌落振荡培养 ,分离制备高纯度杆粒DNA .以重组病毒适量感染昆虫细胞Tn 5B1 4 ,利用Bac to Bac杆状病毒表达系统在昆虫细胞Tn 5B1 4 (Hi5 )中表达相应的重组蛋白 .应用昆虫杆状病毒表达系统 (Bac to Bac)在昆虫细胞Tn 5B1 4中分别高效表达了人细胞周期蛋白D1和CDK4蛋白 .SDS PAGE分析表明 ,表达量占细胞可溶性蛋白质的 2 0 %左右 ,表达产物经Ni2 + NTA亲和层析纯化后纯度达 85 %以上 .研究表明 ,昆虫细胞表达的细胞周期蛋白D1和CDK4蛋白能促进Rb蛋白的磷酸化 ,具有生物活性 .成功构建了细胞周期蛋白D1及CDK4真核杆状病毒表达载体 ,并且在昆虫细胞中正确表达了具有生物活性的细胞周期蛋白D1及CDK4融合蛋白 .     

狂犬病病毒N基因的杆状病毒表达及鉴定

利用分子克隆的方法,将CVS-11株狂犬病毒N基因片段克隆入杆状病毒穿梭载体Bacmid中,构建出含CVS-11 NP基因重组杆状病毒表达质粒Bacmid-N;脂质体介导Bacmid-N转染Sf9昆虫细胞获得表达CVS-11 NP的重组杆状病毒(AcMNPV-N)。用ELISA、FA、SDS-PAGE和Western-blot法对表达产物进行鉴定和分析,证实CVS-11 NP为胞内表达,且具有天然核蛋白良好的免疫反应性,为进一步研制高效、敏感的狂犬病病毒检测试剂和建立实验室检测方法奠定基础。     

禽呼肠孤病毒σC基因在杆状病毒表达系统中的表达及其活性鉴定

本研究利用Bac-To-Bac杆状病毒表达系统构建重组禽呼肠孤病毒(Avian reovirus,ARV)σC基因的杆状病毒,感染sf9细胞获得表达重组蛋白。首先,将ARVσC基因克隆至pFastBacHTA载体,构建重组供体载体pFσC,将其转化大肠杆菌DHl0Bac感受态细胞,使σC基因整合到Bacmid穿梭载体中,获得重组穿梭载体BacmidσC。通过脂质体介导将其转染到sf9昆虫细胞中,获得重组杆状病毒rBacσC。通过Western Blot、间接免疫荧光试验(IFA)进行检测,结果显示:σC蛋白在重组杆状病毒rBacσC感染的sf9昆虫细胞中获得正确表达,分子质量约为37kD,表达的σC蛋白具有良好的反应活性。     

猪瘟病毒E2基因在昆虫细胞/杆状病毒中的表达

目的利用昆虫细胞/杆状病毒系统表达猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白,用于E2蛋白功能、开发CSF新型疫苗以及建立相关血清学诊断方法等研究。方法采用RT-PCR扩增CSFV E2基因,将PCR产物克隆到pGEM-T-Easy载体,将该基因插入到pFast-BacHT A载体中,构建重组转座载体后转化DH10Bac感受态细胞,获得重组Bacmid质粒后转染sf9昆虫细胞,传毒3代,对表达蛋白进行Western-blot及免疫组化鉴定。结果成功克隆CSFVE2基因,其核苷酸序列为1119 bp。SDS-PAGE电泳结果显示表达E2蛋白相对分子质量约为43×103,Western-blot和免疫组化结果证实表达蛋白能够被CSFV标准阳性血清识别。结论在Bac-to-Bac杆状病毒系统中的成功表达了CSFV E2蛋白,与CSFV标准阳性血清具有较好的反应性。     

以杆状病毒为载体在鸡原代骨骼肌细胞中表达IBDV VP2基因

摘要：【目的】本研究旨在构建在鸡原代骨骼肌细胞中表达IBDV病毒VP2基因的重组杆状病毒。【方法】从IBDV适应细胞毒中提取RNA,用RT-PCR技术扩增VP2基因,将其克隆到自主构建的杆状病毒转移载体的CMV启动子之下,通过Bac-to-Bac系统获得VP2重组Bacmid,并将其转染Sf9昆虫 细胞,获得了VP2重组杆状病毒。重组病毒经扩增后以50个MOI感染鸡原代骨骼肌细胞,接种72h后裂解细胞收获蛋白。【结果】蛋白样品经SDS-PAGE和Western blot证实VP2蛋白获得表达,分子量约48kDa,与预测蛋白大小一致,且能被IBDV阳性血清所识别。【结论】重组杆状病毒可以有效地将VP2基因导入鸡原代细胞,并在CMV的启动下表达具有抗原性的VP2蛋白,本研究为研制IBDV及其他重要禽类传染病的杆状病毒载体疫苗奠定了基础。     

人视黄醇结合蛋白4在杆状病毒系统中的表达及其多克隆抗体制备

旨在利用杆状病毒系统表达、制备人视黄醇结合蛋白(RBP4)并检测其免疫原性。将人RBP4基因片段及信号肽SS64片段亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBac-dual(pFBd)中,获得相应的重组转移质粒;转化大肠杆菌菌株DH10bac,转座后经筛选获得重组穿梭质粒rbacmid,将重组穿梭质粒转染孔板培养的Sf9细胞,获得含人RBP4表达框的重组杆状病毒,经过扩增获得毒种。毒种感染对数生长期的Sf9细胞并表达人RBP4蛋白(I-RBP4),通过SDS-PAGE和Western blotting对表达蛋白进行检测和鉴定。用毒种感染悬浮培养的Sf9细胞制备一批RBP4蛋白,完成SDS、Western blotting的检测及少量的多抗制备。纯化重组蛋白并与E.coli重组人RBP4(E-RBP4)分别免疫家兔。实验结果,酶切鉴定及测序证实重组转移质粒构建正确;成功构建重组RBP4-bacmid;人RBP4蛋白在昆虫细胞获得高效表达。表达的RBP4蛋白可以分泌到培养基中,分子量约为23 kDa,经过计算表达量为100 mg/L;纯化蛋白免疫兔子制备了多抗血清,血清滴度为1∶100 000,高于原核表达的抗体滴度(1∶10 000),与人体提纯蛋白制备的抗体滴度相近。杆状病毒系统高效表达了人的RBP4蛋白,具有较好的抗原性,并获得高亲和力的抗血清,为下一步的人血RBP4检测试剂盒的制备打下了坚实的基础。     

汉坦病毒H8205株G1P基因片段重组杆状病毒表达载体的构建及表达

将汉坦病毒H8205株G1P基因的保守序列(约1000bp)作为目的基因插入到BactoBac杆状病毒表达系统的pFastBacHTb供体质粒中,利用Tn7转座子同BacmidDNA同源重组,获得了含目的基因片段的重组杆状病毒DNA,并利用其转染Sf9昆虫细胞,72h后收集细胞悬液,再用该悬液侵染Sf9昆虫细胞,48h后收获病毒.采用IFA分析收获的产物,观察到了特异性的荧光,并且采用SDSPAGE和Western印迹也获得了与预期一致的结果.证明感染后的Sf9昆虫细胞所表达的蛋白中含有能与抗汉坦病毒H8205株多克隆抗体特异性结合目的蛋白.研究表明,采用杆状病毒表达系统可以成功表达出汉坦病毒H8205株包膜糖蛋白G1基因片段,为开发适合的以G1P为抗原的汉坦病毒诊断试剂进行了前期的探索.     

利用杆状病毒Bac-to-Bac系统在Sf9细胞中表达真菌细胞色素P450nor

利用BactoBac杆状病毒载体表达系统将真菌细胞色素P450nor基因克隆至转移载体pFastBac1中, 得到重组质粒pFastBacP450nor, 再将其转化进入含穿梭载体Bacmid的受体菌DH10Bac中发生转座作用, 得到含P450nor基因的重组穿梭载体rBacmid pAcP450nor。分离提取重组Bacmid DNA, 并转染培养的昆虫细胞Sf9, 得到重组病毒rAcp450nor。经酶切和PCR 鉴定, 细胞色素P450nor基因正确地插入到病毒基因组的多角体蛋白基因启动子下, SDSPAGE分析证明：表达蛋白的分子量为43kD左右。Western blotting分析结果表明：有一条特定的杂交带存在, 且分子量相同（约43kD）。进一步证明了含有真菌细胞色素P450nor基因的重组表达载体和重组病毒构建成功,并在昆虫细胞Sf9中实现了高效表达, 经MTT法测定表达的细胞色素P450nor具有还原NO的生物学活性。     

利用昆虫-杆状病毒表达系统表达人乳头瘤病毒16/18/33/58亚型L1蛋白

目的:通过昆虫-杆状病毒表达系统获得人乳头瘤病毒(HPV)16/18/33/58亚型的主要衣壳蛋白L1。方法:克隆了HPV16/18/33/58亚型的L1蛋白基因,并采用密码子优化策略进行改造(记为HPV16/18/33/58亚型mL1),将优化基因片段插入pFastBac Dual载体获得重组载体,转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞后得到重组Bacmid,转染昆虫Sf9细胞,Western印迹和SDS-PAGE检测重组蛋白的表达。结果:获得了表达HPV16/18/33/58亚型mL1蛋白的重组杆状病毒;Western印迹和SDS-PAGE分析表明该重组杆状病毒感染昆虫Sf9细胞后表达mL1蛋白,且mL1蛋白主要分布在细胞中;优化了蛋白表达时间和感染复数,获得目的蛋白mL1的高效表达。结论:多个亚型HPV L1蛋白的克隆表达,为中国优势血清型疫苗的研制奠定了基础。     

Expression of rice gall dwarf virus outer coat protein gene (<Emphasis Type="Italic">S8</Emphasis>) in insect cells

To obtain the P8 protein of Rice gall dwarf virus (RGDV) with biological activity, its outer coat protein gene S8 was expressed in Spodoptera frugiperda (Sf9) insect cells using the baculovirus expression system. The S8 gene was subcloned into the pFastBac™1 vector, to produce the recombinant baculovirus transfer vector pFB-S8. After transformation, pFB-S8 was introduced into the competent cells (E. coli DH10Bac) containing a shuttle vector, Bacmid, generating the recombinant bacmid rbpFB-S8. After being infected by recombinant baculovirus rvpFB-S8 at different multiplicities of infection, Sf9 cells were collected at different times and analyzed by SDS-PAGE, Western blotting and immunofluorescence microscopy. The expression level of the P8 protein was highest between 48–72 h after transfection of Sf9 cells. Immunofluorescence microscopy showed that P8 protein of RGDV formed punctate structures in the cytoplasm of Sf9 cells.     

杆状病毒AcMNPV p48基因在昆虫细胞中的表达

【目的】p48(ac103)基因在昆虫杆状病毒中高度保守,暗示其具有重要的生物学功能。为了研究该基因的功能,我们首先对该基因的表达特征进行描述。【方法】以杆状病毒代表种——苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus,AcMNPV)的p48基因为研究对象,利用Bac-to-Bac杆状病毒表达载体系统分别构建了在P48蛋白N-端和C-端融合HA-标签,并且携带绿色荧光蛋白基因和多角体蛋白基因的重组Bacmid。将重组Bacmid转染Sf9细胞,收集含病毒的上清去感染Sf9细胞,在感染后不同时间点收集细胞进行SDS-PAGE电泳,利用商业化的HA抗体进行Western blot分析以检测融合蛋白在昆虫细胞中的表达情况。【结果】用C-端融合HA-标签的重组病毒感染细胞后12h即可检测到一条43kDa左右、能与HA抗体发生特异性结合的蛋白条带,该特异性蛋白的表达一直持续到病毒感染后96h。从感染后48h起一直到96h,均能检测到另外一条约26kDa的蛋白条带也能与HA抗体发生特异性结合。在N-端融合HA-标签的重组病毒感染的细胞中没有检测到与HA抗体特异结合的蛋白。【结论】结果表明,p48基因是个晚期基因,在病毒感染的晚期表达,并且该蛋白在昆虫细胞中表达时N-端可能被剪切。     

Expression of Rice Gall Dwarf Virus Outer Coat Protein Gene (S8) in Insect Cells

To obtain the P8 protein of Rice gall dwarf virus (RGDV) with biological activity,its outer coat protein gene S8 was expressed in Spodoptera frugiperda (Sf9) insect cells using the baculovirus expression system.The S8 gene was subcloned into the pFastBacTM1 vector,to produce the recombinant baculovirus transfer vector pFB-S8.After transformation,pFB-S8 was introduced into the competent cells (E.coli DH10Bac) containing a shuttle vector,Bacmid,generating the recombinant bacmid rbpFB-S8.After being infected b...     

Expression of the Mouse Serotonin Receptor (5HT1c) cDNA in Cultured Insect Cells

Baculovirus-mediated cloning and expression of the mouse serotonin receptor (5HT1c) cDNA in insect cells was proposed to create an alternative to the oocyte-based system commonly employed in electrophysiological studies of ionic channels. A recombinant bacmid was constructed, and the 5HT1c cDNA was transferred into the AcNPV genome to yield a recombinant baculovirus. Infected insect Sf9 cells produced recombinant 5HT1c.     

野桑蚕GST-Omega1基因在草地贪夜蛾Sf9细胞中的表达

谷胱甘肽 S-转移酶（glutathione S-transferases,GSTs）是昆虫的重要解毒酶之一。为了研究野桑蚕Bombyx mandarina中谷胱甘肽S-转移酶在真核表达系统中的表达情况。本研究通过RT-PCR从野桑蚕中肠中获得GST-Omega1基因的cDNA序列,该基因的开放读码框为771 bp,编码256 个氨基酸。对推导的氨基酸序列用NCBI的蛋白质Conserved Domains工具进行在线分析,结果显示GST-Omega1的氨基酸序列中具有Cys38和8个GSH结合位点的Omega类基因保守序列。对所获得的基因克隆进表达载体pFastBacHT b中获得pFast-GST-Omega1,将其转化DH10Bac感受态细胞,获得Bac-GST-Omega1重组病毒DNA,用脂质体法转染草地贪夜蛾Sf9细胞,获得重组病毒。对表达产物经SDS-PAGE和Western blotting分析,能检测到一条分子量约为33 kD的特异性条带,与推导的融合蛋白大小相符,该目的蛋白的表达量占总蛋白的14.4%。目的蛋白经His·Bind树脂纯化,用Lineweaver Burk作图法测定其K_m和V_max,结果显示其K_m为2.81 µmol/L,V_max为2.70 µmol/(mg·min）。