汉滩病毒M、S基因不同拼接方式在昆虫细胞中融合表达效果比较

将汉滩病毒囊膜糖蛋白G1与核蛋白(NP)部分片段以不同方式拼 接,构建G1S0.7或S0.7G1嵌合基因,分别插入杆状病毒表达载体pFBD,转化DH10Bac致敏菌, 获得含有嵌合基因的重组穿梭质粒Bacmid,用其转染Sf9细胞,快速筛选出含有G1S0.7或S0.7 G1嵌合 基因的重组杆状病毒,在昆虫细胞中表达外源融合蛋白.利用间接免疫荧光、ELISA和免疫 印迹对表达产物进行检测.结果表明,含G1S0.7嵌合基因之重组杆状病毒可在昆虫细胞中表 达出融合蛋白,该蛋白可被抗汉滩病毒核蛋白及糖蛋白G1特异性单抗所识别,其分子量约97 kD;含S0.7G1嵌合基因之重组杆状病毒在昆虫细胞中表达的融合蛋白,只能被抗汉滩病毒核 蛋白特异性单抗所识别,其分子量约43kD.上述结果提示,G1S0.7嵌合基因可能在昆虫细胞 中表达出完整的具有生物学活性的融合蛋白,S0.7G1嵌和基因的昆虫细胞表达产物不完整 ,且生物学活性不如G1S0.7嵌合基因的表达产物.     

汉坦病毒嵌合基因 G2S0.7在昆虫细胞中融合表达产物的免疫学研究

在前期工作基础上,对汉坦病毒糖蛋白(GP)和核蛋白(NP)的嵌合基因G2S0．7表达产物的免疫学特性进行进一步的研究。将汉坦病毒含有G2S0．7嵌合基因的重组杆状病毒在昆虫细胞中融合表达并免疫BALB／c小鼠,用ELISA、微量细胞培养中和实验及淋巴细胞增殖实验检测免疫应答效果,以研究嵌合基因的免疫效果。结果表明,用该融合蛋白免疫小鼠,可诱导产生抗汉坦病毒NP及GP特异性的抗体,抗体效价分别为1：3200及1：200;同时融合蛋白还可刺激机体产生低水平的中和抗体和明确的淋巴细胞增殖反应。说明汉坦病毒G2S0．7嵌合基因表达的融合蛋白既可刺激机体产生特异性的抗汉坦病毒体液免疫应答,也可刺激机体产生特异性的细胞免疫应答,为进一步进行汉坦病毒基因工程疫苗的研究奠定了实验基础。     

汉滩病毒M和S基因不同拼接方式嵌合基因免疫效果的研究

本文在前期工作的基础上,构建了汉滩病毒76－118株M基因G2片段与S基因5'端0.7Kb片段的嵌合基因真核表达载体pcDNA3.1-G2S0.7及pcDNA3.1-S0．7G2;用该质粒免疫BALB/c小鼠,结果表明两种质粒免疫小鼠可同时诱导产生抗滩滩病核蛋白（NP)及糖蛋白（GP）特异性的抗体,且前者刺激产生的抗体效价明显高于后者。淋巴细胞增殖实验表明,pcDNA3.1-G2S0.7组免疫小鼠脾细胞时NP及GP的增殖指数均明显高于空载体对照组,而pcDNA3.1-S0．7G2组未检测到其淋巴细胞有明显的增殖。这说明汉滩病毒M基因G2片段及S基因0.7Kb片段的嵌合基因既可刺激机体产生特异的抗汉滩病毒体液免疫应答,也可刺激机体产生特异的细胞免疫应答。不同拼接方式对嵌合基因免疫效果有很大影响,嵌合基因G2S0．7这种拼接方式明显优于S0．7G2。     

重组杆状病毒表达尼帕病毒融合蛋白和受体结合蛋白的研究

构建了表达尼帕病毒(Nipah virus,NiV)囊膜功能糖蛋白F和G的重组杆状病毒rBac-NF、rBac-NG。Western-blot证实大小分别为61kD和66kD的重组融合蛋白(rNF)和受体结合蛋白(rNG)分别在rBac-NF、rBac-NG感染的昆虫细胞中获得表达,并且rNF前体F0可在昆虫细胞内进一步有效裂解为F1(~49kD)和F2;采用兔抗NiV病毒高免血清间接免疫荧光检测重组杆状病毒表达F和G蛋白显示出良好的特异免疫反应原性。以rBac-NF、rBac-NG感染的昆虫细胞裂解液稀释后直接包被ELISA板,间接ELISA检测兔抗灭活NiV全病毒高免血清中的F和G蛋白特异性抗体,同样具有良好的敏感性和特异性;以rBac-NF和rBac-NG感染昆虫细胞培养物直接免疫BALB/c小鼠,可诱导显著的NiVF和G蛋白特异体液免疫反应,产生的特异抗体可有效中和NiV囊膜蛋白F和G介导的伪型VSV重组病毒侵入NiV易感宿主细胞的感染性。结果表明,杆状病毒表达重组F和G蛋白抗原具有替代NiV全病毒,作为安全、经济、敏感和特异的诊断抗原的潜力,并为重组病毒亚单位疫苗防制尼帕病毒性脑炎的探索研究奠定了基础。     

抗癌胚抗原单链抗体基因与核心链霉亲和素基因融合在昆虫细胞中的表达

将抗癌胚抗原单链抗体基因与核心链霉亲和素基因融合插入昆虫杆状病毒供体质粒 pFastBacHTa中 ,在粉纹夜蛾Tn 5B1 4细胞中进行表达。SDS PAGE分析结果表明 ,表达产物分子量为 4 1kD左右 ,Western印迹分析结果表明 ,以HRP标记的生物素进行蛋白质印迹在 4 1kD处可见表达条带 ,表明融合蛋白能特异性的与生物素结合 ,放射免疫分析表明重组杆状病毒表达产生的ScFv CS蛋白能特异性结合癌胚抗原     

汉滩病毒M和S基因不同拼接方式嵌合基因免疫效果的研究

本文在前期工作的基础上,构建了汉滩病毒76-118株M基因G2片段与S基因5'端0.7Kb片段的嵌合基因真核表达载体pcDNA3.1-G2S0.7及pcDNA3.1-S0.7G2;用该质粒免疫BALB/c小鼠,结果表明两种质粒免疫小鼠可同时诱导产生抗汉滩病毒核蛋白(NP)及糖蛋白(GP)特异性的抗体,且前者刺激产生的抗体效价明显高于后者.淋巴细胞增殖实验表明,pcDNA3.1-G2S0.7组免疫小鼠脾细胞时NP及GP的增殖指数均明显高于空载体对照组,而pcDNA3.1-S0.7G2组未检测到其淋巴细胞有明显的增殖.这说明汉滩病毒M基因G2片段及S基因0.7Kb片段的嵌合基因既可刺激机体产生特异的抗汉滩病毒体液免疫应答,也可刺激机体产生特异的细胞免疫应答.不同拼接方式对嵌合基因免疫效果有很大影响,嵌合基因G2S0.7这种拼接方式明显优于S0.7G2.     

汉滩病毒核蛋白的分段表达及抗原表位分析

在大肠杆菌中对汉滩病毒S基因4种不同长度片段的重组表达质粒进行诱导表达.结果表明表达的4种GST-NP融合蛋白均以不溶性包含体形式存在于菌体细胞内,表达量分别占菌体蛋白总量的29-36%,分子量分别约为72 kD、66 kD、54 kD和44 kD.Western blot显示54 kD和72 kD融合蛋白用酶标抗汉滩病毒NP McAb 1A8和抗GST McAb 3C11染色呈阳性反应.66 kD和44 kD融合蛋白仅与酶标3C11呈阳性反应.用凝血酶切去GST,获得4种汉滩病毒重组核蛋白(rNP),分子量分别约为44 kD、40 kD、26 kD和16 kD.用19株McAb对表达产物做抗原位点分析,结果完整的rNP可与19株McAb中的13株反应,McAb反应谱与天然NP相同;S1.1 kb表达产物(N-端1-37和C端402-429位aa缺失)和S 0.5 kb表达产物(N-端1-274位aa缺失)与19株McAb均不发生反应;S0.7 kb表达产物(C-端275-429位aa缺失)可与5株组特异性McAb反应.表明汉坦病毒核蛋白上的抗原位点主要存在于N-端1-37位aa区段内.     

汉坦病毒H8205株G1P基因片段重组杆状病毒表达载体的构建及表达

将汉坦病毒H8205株G1P基因的保守序列(约1000bp)作为目的基因插入到BactoBac杆状病毒表达系统的pFastBacHTb供体质粒中,利用Tn7转座子同BacmidDNA同源重组,获得了含目的基因片段的重组杆状病毒DNA,并利用其转染Sf9昆虫细胞,72h后收集细胞悬液,再用该悬液侵染Sf9昆虫细胞,48h后收获病毒.采用IFA分析收获的产物,观察到了特异性的荧光,并且采用SDSPAGE和Western印迹也获得了与预期一致的结果.证明感染后的Sf9昆虫细胞所表达的蛋白中含有能与抗汉坦病毒H8205株多克隆抗体特异性结合目的蛋白.研究表明,采用杆状病毒表达系统可以成功表达出汉坦病毒H8205株包膜糖蛋白G1基因片段,为开发适合的以G1P为抗原的汉坦病毒诊断试剂进行了前期的探索.     

HIV—1核蛋白p24在昆虫细胞中的表达

将完整的ＨＩＶ－１ ｐ２４基因克隆到杆状病毒转移质粒中,使用重组转移质粒与野生型杆状病毒ＤＮＡ共转染Ｓｆ９昆虫细胞,经筛选获得带有编码ｐ２４基因的重组杆状病毒。重组杆状病毒感染Ｓｆ９细胞后在细胞中表达了ＨＩＶ核蛋白ｐ２４。其重组蛋白的分子量为２４ｋＤ。此重组糖蛋白在免疫荧光,免疫印染和酶联免疫实验中都能被人ＨＩＶ－１阳性血清和单克隆抗体所识别。     

人细胞周期蛋白D1/CDK4基因的真核表达及生物活性鉴定

通过生物工程获得人重组细胞周期蛋白 (cyclinD1 )及细胞周期蛋白激酶CDK4蛋白 ,作为抗癌药物筛选的分子靶点 .从人HL 6 0细胞中获得细胞周期蛋白D1 CDK4基因的cDNA ,先克隆至pGEMT Easy载体上 ,再经重组构建供体质粒pFastBac D1和pFastBac CDK4 .重组供体质粒转化感受态DH1 0Bac细胞 ,挑取确证为白色克隆的菌落振荡培养 ,分离制备高纯度杆粒DNA .以重组病毒适量感染昆虫细胞Tn 5B1 4 ,利用Bac to Bac杆状病毒表达系统在昆虫细胞Tn 5B1 4 (Hi5 )中表达相应的重组蛋白 .应用昆虫杆状病毒表达系统 (Bac to Bac)在昆虫细胞Tn 5B1 4中分别高效表达了人细胞周期蛋白D1和CDK4蛋白 .SDS PAGE分析表明 ,表达量占细胞可溶性蛋白质的 2 0 %左右 ,表达产物经Ni2 + NTA亲和层析纯化后纯度达 85 %以上 .研究表明 ,昆虫细胞表达的细胞周期蛋白D1和CDK4蛋白能促进Rb蛋白的磷酸化 ,具有生物活性 .成功构建了细胞周期蛋白D1及CDK4真核杆状病毒表达载体 ,并且在昆虫细胞中正确表达了具有生物活性的细胞周期蛋白D1及CDK4融合蛋白 .     

汉坦病毒囊膜糖蛋白G1基因重组腺病毒载体的构建及其在Vero E6细胞中的表达

拟构建汉坦病毒Gl基因重组腺病毒载体并在VeroE6细胞中表达,为汉坦病毒基因疫苗的研究提供实验基础。PCR法从含汉坦病毒-76118株M基因的M56质粒扩增糖蛋白G1基因片段,利用穿梭质粒pShuttle,将其克隆入Adeno—X病毒DNA,获得重组腺病毒DNA,转染HEK293细胞,包装、扩增后得到汉坦病毒Gl基因重组腺病毒原种,感染VetoE6细胞,用IFA法和ELISA法检测表达产物。得到了含汉坦病毒G1基因的重组腺病毒,其滴度约为10^11pfu／ml,感染VeroE6细胞后检测到汉坦病毒糖蛋白G1的表达。     

庚型肝炎病毒包膜糖蛋白E2基因在昆虫细胞中的表达

用ＰＣＲ扩增出ＨＧＶＥ２全基因,克隆进杆状病毒表达载体ｐＦＡＳＴＢＡＣＨＴａ中,构建成重组转座载体ｐＦＡＳＴＢＡＣＥ２,转化ＤＨ１０ＢＡＣ大肠杆菌感受态细胞,筛选阳性菌落,抽提大分子质粒ＤＮＡ,获得含ＨＧＶＥ２基因的重组杆状病毒穿梭载体,转染昆虫草地夜蛾Ｓｆ９细胞,出现细胞病变后,收集含有重组病毒颗粒的培养上清,重新感染草地夜蛾Ｓｆ９单层细胞及甜菜夜蛾幼虫,分别收集Ｓｆ９细胞和甜菜夜蛾幼虫体内的血淋巴细胞,进行１２％ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳,可见表达的融合蛋白带,经亲和层析进行蛋白纯化,用ＥＬＩＳＡ方法检测各类血清标本,初步研究ＨＧＶＥ２糖蛋白的抗原性     

Expression of recombinant anti‐colorectal cancer large single‐chain monoclonal antibody in insect cells

Colorectal cancer is the third most commonly diagnosed cancer in the world. Monoclonal antibody (mAb) CO17‐1A recognizes the tumor‐associated antigen GA733‐2, a cell surface glycoprotein highly expressed in colorectal carcinoma cells which is applicable for preventing and curing colorectal cancer. In this study, we tried to produce a new recombinant anti‐colorectal cancer large single chain (lsc) mAb based on mAb CO17‐1A in the baculovirus‐insect cell protein expression system. Two kinds of recombinant lsc mAbs were generated where variable light chain (VL) and heavy chain (HC) of mAb CO17‐1A were fused together by an interchain linker. The only difference between the two mAbs is based on fusion of an ER retention signal (KDEL) at its C‐terminus of HC. Polymerase chain reaction analysis verified the presence of both recombinant genes in the bacmid for generating viral expression vectors in insect cells. Western blot confirmed the expression of lsc mAbs in baculovirus‐infected insect cells. Cell enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) showed that the mAbs from cell lysates bound to SW480 and SW620 human colorectal cancer cells. These results indicate that the baculovirus insect expression system can produce anti‐colorectal lsc mAb recognizing human colorectal cancer cells.     

The expression and genetic immunization of chimeric fragment of Hantaan virus M and S segments

Hemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS), which is characterized by severe symptoms and high mortality, is caused by hantavirus. There are still no effective prophylactic vaccines directed to HFRS until now. In this research, we fused expressed G2 fragment of M segment and 0.7kb fragment of S segment. We expect it could be a candidate vaccine. Chimeric gene G2S0.7 was first expressed in prokaryotic expression system pGEX-4T. After inducing expressed fusion proteins, GST-G2S0.7 was induced and its molecular weight was about 100kDa. Meanwhile, the fusion protein kept the activity of its parental proteins. Further, BALB/c mice were vaccinated by the chimeric gene. ELISA, cell microculture neutralization test in vitro were used to detect the humoral immune response in immunized BALB/c mice. Lymphocyte proliferation assay was used to detect the cellular immune response. The results showed that the chimeric gene could simultaneously evoke specific antibody against nucleocapsid protein (NP) and glycoprotein (GP). And the immunized mice of every group elicited neutralizing antibodies with different titers. But the titers were low. Lymphocyte proliferation assay results showed that the stimulation indexes of splenocytes of chimeric gene to NP and GP were significantly higher than that of control. It suggested that the chimeric gene of Hantaan virus containing G2 fragment of M segment and 0.7kb fragment of S segment could directly elicit specific anti-Hantaan virus humoral and cellular immune response in BALB/c mice.     

Expression of Rice Gall Dwarf Virus Outer Coat Protein Gene (S8) in Insect Cells

To obtain the P8 protein of Rice gall dwarf virus (RGDV) with biological activity,its outer coat protein gene S8 was expressed in Spodoptera frugiperda (Sf9) insect cells using the baculovirus expression system.The S8 gene was subcloned into the pFastBacTM1 vector,to produce the recombinant baculovirus transfer vector pFB-S8.After transformation,pFB-S8 was introduced into the competent cells (E.coli DH10Bac) containing a shuttle vector,Bacmid,generating the recombinant bacmid rbpFB-S8.After being infected b...     

伪狂犬病病毒鄂A株包膜糖蛋白gD基因的克隆与表达

克隆了伪狂犬病病毒鄂A株编码包膜糖蛋白gD的基因并进行了序列测定 ,与国外报道的Rice株相比 ,其核苷酸序列具有 98%的同源性 ,推导氨基酸序列同源性为 97%。将此基因克隆于具有全期启动子盒的杆状病毒转移载体pSX35A中 ,构建成重组转移质粒pSX35A gD ,与致死缺失型线性化苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒 (AcMNPV OCC- )基因组DNA一起共转染粉纹夜蛾Hi5细胞 ,经同源重组 ,获得含gD基因的重组病毒AcMNPV OCC+ gD。重组病毒经空斑纯化后感染Hi5细胞进行表达分析 ,细胞裂解物的SDS PAGE及Western Blot ting均显示分子量约 47kD的gD蛋白得到了特异性表达 ,其表达量占细胞总蛋白的 6 2 % ,表达的gD蛋白具有免疫原性。     

Ligand-directed gene targeting to mammalian cells by pseudotype baculoviruses

The baculovirus Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) can infect a variety of mammalian cells, as well as insect cells, facilitating its use as a viral vector for gene delivery into mammalian cells. Glycoprotein gp64, a major component of the budded AcMNPV envelope, is involved in viral entry into cells by receptor-mediated endocytosis and subsequent membrane fusion. We examined the potential production of pseudotype baculovirus particles transiently carrying ligands of interest in place of gp64 as a method of ligand-directed gene delivery into target cells. During amplification of a gp64-null pseudotype baculovirus carrying a green fluorescent protein gene in gp64-expressing insect cells, however, we observed the high-frequency appearance of a replication-competent virus incorporating the gp64 gene into the viral genome. To avoid generation of replication-competent revertants, we prepared pseudotype baculoviruses by transfection with recombinant bacmids without further amplification in the gp64-expressing cells. We constructed gp64-null recombinant bacmids carrying cDNAs encoding either vesicular stomatitis virus G protein (VSVG) or measles virus receptors (CD46 or SLAM). The VSVG pseudotype baculovirus efficiently transduced a reporter gene into a variety of mammalian cell lines, while CD46 and SLAM pseudotype baculoviruses allowed ligand-receptor-directed reporter gene transduction into target cells expressing measles virus envelope glycoproteins. Gene transduction mediated by the pseudotype baculoviruses could be inhibited by pretreatment with specific antibodies. These results indicate the possible application of pseudotype baculoviruses in ligand-directed gene delivery into target cells.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因在昆虫细胞中的高效融合表达

对杆状病毒BactoBac表达系统的转座质粒pFastbac1进行改造,即在其多角体蛋白启动子下游插入谷胱苷肽S转移酶（glutathioneStransferase, GST）基因,构建GST融合表达转座质粒pFGST。通过转座和转染Sf9细胞,证实该系统能高水平表达GST。采用PCR方法从pMTgp51质粒中扩增截去N端信号肽序列的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）YA株ORF5基因,并将截短的ORF5基因片段克隆到pFGST中,使之与GST融合,构建的重组转座质粒pFGST53转染DH10Bac,提取大分子Bacmid DNA,转染Sf9细胞,获得能表达融合蛋白的高滴度重组病毒rvGST53。rvGST53感染Sf9细胞,SDSPAGE和Western印迹分析表明：与GST融合的ORF5基因在Sf9细胞中获得高效表达,表达产物分子量为45kD,能与抗PRRSV E蛋白单克隆抗体发生特异性反应。将表达产物免疫小白鼠,经间接免疫荧光检测,免疫血清能使PRRSV YA株感染的MARC145细胞呈较强的荧光着色,证实表达的融合蛋白具有良好的免疫原性。