失活 ChiA 和 v-cath 基因的重组BmNPV 表达 hGM-CSF

利用 DNA 同源重组技术使家蚕核型多角体病毒的多角体蛋白基因取代 v-cath 、 ChiA 两基因的部分编码区域和共同的启动子区域,获得了 v-cath 、 ChiA 两基因同时失活的、可形成多角体的、并能表达人粒细胞 - 巨噬细胞集落刺激因子的重组病毒 BmNPVpolh+CP－ChiA－GMCSF+. 研究结果显示： v-cath 、 ChiA 两基因的失活不影响病毒的复制及多角体的形成,但感染细胞的存活时间比野生病毒感染的多 2 天,可明显改善外源基因在培养细胞和家蚕中的表达水平;感染 BmNPV polh+CP－ChiA－GMCSF+的家蚕幼虫体表保持正常,无野生病毒感染后引起的破皮流脓现象 .     

家蚕hsp20.4启动子克隆及其驱动表达产物EGT对家蚕蛹体发育的影响

为验证家蚕Bombyx mori热休克蛋白基因hsp20.4启动子的活性以及家蚕核多角体病毒egt的表达产物对家蚕发育的影响, 本实验通过PCR扩增分别得到hsp20.4启动子片段和egt片段。利用hsp20.4的启动子和红色荧光蛋白报告基因DsRed构建重组载体, 在家蚕BmN细胞以及家蚕组织中得到了瞬时表达, 表明所克隆的hsp20.4启动子序列具有热休克蛋白基因的启动子活性。又利用hsp20.4启动子和家蚕核多角体病毒的egt构建重组载体, 通过注射到蚕蛹中进行瞬时表达, 以检测egt表达产物对家蚕发育的影响, 经42℃ 1 h热诱导后, hsp20.4启动子控制的egt表达产物可以延迟家蚕发育。     

Bac-to-Bac/BmNPV杆状病毒在家蚕幼虫中表达重组鲎C因子

鲎C因子是鲎血细胞中一种对内毒素具有高亲和力的丝氨酸蛋白酶,被内毒素激活后可水解人工合成的三肽底物,因而能替代传统的鲎试剂用于内毒素检测。通过RT-PCR从东方鲎血细胞中扩增出鲎C因子基因(factor C)序列,利用Bac-to-Bac/BmNPV杆状病毒表达系统在家蚕幼虫中表达该蛋白,并对其进行活性测定。结果显示:被感染的家蚕血清稀释后能检测到Factor C活性,稀释500倍的血清可以用于内毒素检测,且其灵敏度能达到0.2 EU/mL,有望开发新型的、低成本的内毒素检测试剂。     

家蚕丝蛋白Fhx/P25基因启动子区域的克隆及序列分析

为研究家蚕Fhx/P25基因在时空上的调控机制，通过PCR扩增获得家蚕丝素蛋白Fhx/P25基因的启动子序列并进行克隆和序列分析。进一步构建了由Fhx/P25启动子驱动报告基因DsRed的表达载体pSK-P25-DsRed-PolyA，并通过家蚕BmN细胞进行瞬时表达。结果显示：Fhx/P25基因的启动子序列符合真核生物启动子特点，具有丝腺特异性表达启动子的特征，TATA框的保守序列为TATAA，位于-28—-32处，CAAT基序有3个，其中-110—-117和-90—-87处的2个CAAT基序可能具有活性；二级结构分析显示：Fhx/P25启动子区域具有复杂的茎环结构，这可能与蛋白表达的组织特异性、时间性以及活性有关。基因启动子可以驱动红色荧光基因DsRed在家蚕BmN培养细胞中的瞬时表达。     

家蚕丝蛋白Fhx/P25基因启动子区域的克隆及序列分析

为研究家蚕Fhx/P25基因在时空上的调控机制,通过PCR扩增获得家蚕丝素蛋白Fhx/P25基因的启动子序列并进行克隆和序列分析。进一步构建了由Fhx/P25启动子驱动报告基因DsRed的表达载体pSK-P25-DsRed-PolyA,并通过家蚕BmN细胞进行瞬时表达。结果显示:Fhx/P25基因的启动子序列符合真核生物启动子特点,具有丝腺特异性表达启动子的特征,TATA框的保守序列为TATAA,位于-28—-32处,CAAT基序有3个,其中-110—-117和-90—-87处的2个CAAT基序可能具有活性;二级结构分析显示:Fhx/P25启动子区域具有复杂的茎环结构,这可能与蛋白表达的组织特异性、时间性以及活性有关。基因启动子可以驱动红色荧光基因DsRed在家蚕BmN培养细胞中的瞬时表达。     

中华绒螯蟹组织中一株类志贺邻单胞菌的分离与特性分析

从江苏省启东市某水产养殖场患病的中华绒螯蟹组织中,分离到一株类志贺邻单胞菌,定名为JE－1株。该菌株为革兰阴性短杆菌,具端生单鞭毛,主要生化特性为氧化酶阳性,发酵葡萄糖产酸不产气,发酵麦芽糖,乳糖,肌醇等。不发酵甘露醇,鼠李糖,阿拉伯糖等;触酶,精氨酸双水解酶,鸟氨酸脱羧酶,赖氨酸脱羧酶阳性,对小鼠,鹌鹑,鲫鱼血细胞无溶血性,最适生长条件为温度28℃,pH7,含1％NaCl,经健康蟹回感,未见发病。     

美国白蛾核型多角体病毒超氧化物歧化酶基因的序列分析和表达

根据测序结果 ,HcNPVsod的核苷酸序列与BmNPVsod的完全一致 ,与AcNPVsod的核苷酸序列相比 ,同源性达到 97 2 % ;推测HcNPVsod编码 1 51个氨基酸 ,与BmNPVsod的完全一致 ,与AcNPVsod编码的氨基酸相比 ,有三个氨基酸的差别。按基酸序列分析表明 ,HcNPVSOD蛋白中含有对SOD结构和活性必需的氨基酸残基 ,在HcNPVsod中均是保守的。SOD活性测定表明酶活为 1 47 0 9U/mL菌液     

蟹组织中致病性嗜水气单胞菌的分离及其特性

1999年 6月从江苏省启东市某水产养殖场患病濒死的中华绒螯蟹肝胰腺中分离出 3株致病菌。经回感实验证实了菌株在 2 4h内对健康蟹的致死率分别为 10 0 %、75 %和 6 0 % ,回感温度升高可导致死亡时间缩短。经细菌形态、生理生化特性等鉴定为嗜水气单胞菌 ,分别定名为 ES- 1、ES- 2和 ES- 3菌株。3株菌的最适生长温度在 35℃ ,p H8,Na Cl浓度 0～ 1%。     

美国白蛾核型多角体病毒几丁质酶基因核苷酸序列研究

美国白蛾核型多角体病毒编码的几丁质酶Ａ基因定位在ＨｉｎｄⅢ－３．５ｋｂ片段上,ＤＮＡ测序表明,半胱氨酸蛋白酶基因的５’上游反向存在ＣｈｉＡ基因,ＣｈｉＡ基因的ＯＲＦ为１６６２个核苷酸,编码５５３个氨基酸,５‘,３’－非编码区分别具有ＴＡＡＧ基序和ＡＡＴＡＡＡｐｏｌｙ（Ａ＾＋）信号序列。     

HcNPV半胱氨酸蛋白酶,几丁质酶基因失活分析

将含有美国白蛾核型多角体病毒（Ｈｙｐｈａｎｔｒｉａ ｃｕｍｅａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ,ＨｃＮＰＶ）半胱氨酸蛋白酶基因（ＣＰ）的自然和几丁质酶基因（ＣｈｉＡ）的片段克隆进ＰＣＲⅡ,构建了转移载体ｐＨｃＣＶｄｅｌ;将含有ＨｃＮＰＶ多角体蛋白全基因（ｐｏｌｈ）序列的片段插入到ｐＨｃＣＶｄｅｌ的ＥｃｏＲＩ位点,得到重组转移载体ｐＨｃＣＶｐｏｌｈ。通过重组转移载体与含有家蚕促