人视黄醇结合蛋白4在杆状病毒系统中的表达及其多克隆抗体制备

旨在利用杆状病毒系统表达、制备人视黄醇结合蛋白(RBP4)并检测其免疫原性。将人RBP4基因片段及信号肽SS64片段亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBac-dual(pFBd)中,获得相应的重组转移质粒;转化大肠杆菌菌株DH10bac,转座后经筛选获得重组穿梭质粒rbacmid,将重组穿梭质粒转染孔板培养的Sf9细胞,获得含人RBP4表达框的重组杆状病毒,经过扩增获得毒种。毒种感染对数生长期的Sf9细胞并表达人RBP4蛋白(I-RBP4),通过SDS-PAGE和Western blotting对表达蛋白进行检测和鉴定。用毒种感染悬浮培养的Sf9细胞制备一批RBP4蛋白,完成SDS、Western blotting的检测及少量的多抗制备。纯化重组蛋白并与E.coli重组人RBP4(E-RBP4)分别免疫家兔。实验结果,酶切鉴定及测序证实重组转移质粒构建正确;成功构建重组RBP4-bacmid;人RBP4蛋白在昆虫细胞获得高效表达。表达的RBP4蛋白可以分泌到培养基中,分子量约为23 kDa,经过计算表达量为100 mg/L;纯化蛋白免疫兔子制备了多抗血清,血清滴度为1∶100 000,高于原核表达的抗体滴度(1∶10 000),与人体提纯蛋白制备的抗体滴度相近。杆状病毒系统高效表达了人的RBP4蛋白,具有较好的抗原性,并获得高亲和力的抗血清,为下一步的人血RBP4检测试剂盒的制备打下了坚实的基础。     

汉逊酵母重组表达的人胃蛋白酶原Ⅱ校准品研制

目的：探索一种高效制备人胃蛋白酶原Ⅱ（pepsiongenⅡ,PGⅡ）体外诊断试剂用校准品的方法。方法：以汉逊酵母ATCC26012作为宿主菌,以携带Zeocin及G418双重筛选标记的pRMHP2.1质粒为载体,以遗传密码子优化设计后的PGⅡ序列为目的基因,通过电转化及后续多轮次的传代与稳定,筛选获得高水平分泌表达PGII蛋白的重组菌株26012/PGⅡ。采用Ni柱亲和层析的方法从200L发酵罐大量制备的培养液中纯化出高纯度的重组PGⅡ蛋白,将该蛋白质进行校准定值后配制成6种不同浓度的成套PGⅡ校准品,并对该系列校准品的实时稳定性、加速破坏性及开瓶稳定性展开评价。结果：筛选获得的重组汉逊酵母菌株26012/PGⅡ外源基因整合拷贝数高于40个且整合于染色体的rDNA位置,该菌株以分泌形式表达重组PGⅡ蛋白,表达量超过50mg/L,发酵培养液经Ni柱亲和层析纯化后,重组PGⅡ蛋白纯度达93.8%。通过免疫比浊试剂盒定量检测,该PGⅡ蛋白的活性定值与实际蛋白质量之间的比值达0.85,配制后的PGⅡ校准品在4℃实时保存1年、37℃加速破坏2周及4℃开盖保存2周后,校准品定值的平均下降幅度都不超过10%,其稳定性能不逊色于商品化的校准品。结论：汉逊酵母重组表达的PGⅡ蛋白可用作体外诊断试剂的校准品。