用地高辛标记探针检测基因工程人β干扰素制品中的外源DNA

基因工程人β干扰素工程菌经发酵培养、纯化后获得纯的制品,采用斑点杂交技术,用非放射性地高辛标记超声裂解的全工程菌ＤＮＡ作为探针,检测基因工程人β干扰素纯品,结果显示：基因工程人β干扰素纯品中的外源ＤＮＡ含量小于１００ｐｇ／剂。     

疫苗分离纯化研究进展

综述了国内外关于疫苗分离纯化的研究进展,系统介绍了目前可用作各类疫苗(尤其是基因工程疫苗)分离纯化的方法。沉淀和离心等传统分离技术在各类疫苗的分离纯化中应用广泛,层析技术和其它分离技术的结合已成为疫苗分离纯化的主流,新型膜技术和亲和层析在基因工程亚单位疫苗分离纯化中的作用引人注目。     

蛋白质凝胶过滤色谱上样方法的改进

凝胶过滤色谱因其操作方法简单,重复性强等特点在生物大分子的分离纯化中被广泛使用。特别在基因工程蛋白质类药物的精细纯化中起着难以替代的作用。但由于蛋白质凝胶过滤色谱要求样品上样体积较小及洗脱流速较小时才能获得理想的分辨率,这使得凝胶过滤色谱经常成为蛋白质大规模纯化工艺中的限速步骤。本介绍一种改进的上样方法,在不降低分辨率的前提下,可将单位时间内凝胶过滤柱的产量提高两倍。     

绿色荧光蛋白的原核表达纯化用于基因工程大实验的设计

目的通过设计基因工程实验为一综合性探究实验,使学生全面掌握并提升基因工程相关实验技能。方法借助于绿色荧光蛋白的原核表达及纯化实验,使学生掌握了基因的克隆与表达、以及蛋白纯化等综合实验性技术方法。结果将以前支离破碎的一个个单个实验环环相扣成为一个整体,最终学生可获得一个肉眼可见的基因工程产物即绿色荧光蛋白。结论通过基因工程实验的改革提高了学生的学习兴趣,得到了良好的学习效果。     

重组刺桐胰蛋白酶抑制剂a在大肠杆菌中的表达和纯化

为了大量制备重组刺桐胰蛋白酶抑制剂a(rETIa) ,对构建的基因工程菌株E .coliBL2 1(DE3)pET2 2b mETIa进行了表达条件的优化 .用摇瓶培养 ,rETIa蛋白占菌体总蛋白 4 0 %以上 .经破碎菌体 洗涤包涵体 溶解包涵体 复性初步纯化后 ,再经二步柱层析纯化获得电泳纯的rETIa蛋白 .测定了rETIa对胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、组织型纤溶酶原激活因子缺失突变体 (NTA)的抑制活性 .     

毕赤酵母生孢诱导条件的优化研究

毕赤酵母(Pichia pastoris)作为现在常用的基因工程菌株,常常会用其单倍体进行基因改良操作来达到基因工程菌株纯化的目的。在通过对毕赤酵母X-33培养过程中不同温度、碳源、盐离子及其浓度梯度等因素进行研究中,探讨其生孢诱导因子及其最佳条件。结果表明其最佳生孢条件:用YPD培养基进行预培养72h,连续2次传代后将菌涂布于乙酸钠1%,氯化钾0.6%,葡萄糖1%,微量元素0.1%,琼脂2%的诱导培养基上,28℃培养箱中培养7 d,其生孢率能达72%。结果还表明K+和Ac-是诱导毕赤酵母生孢的关键因子。     

毕赤酵母表达体系中重组蛋白的分离纯化

随着基因重组技术的快速发展,基因工程产品的利用越来越广泛,但其分离纯化的成本约占总成本的60%～70%.因此,探索一些简单有效的分离纯化方法尤为必要.简单介绍了目前较为流行的毕赤酵母表达体系,着重概述了重组蛋白分离纯化技术方法的应用情况.     

基因工程技术在基础与临床医学上的应用

前言 基因工程的核心技术是分子克隆,它是70年代后期发展起来的新技术。通过分子克隆技术,可以把任何一种外源基因经过剪切,与适当的运载体(质粒或噬菌体)重组,再转化到细菌中,即可使这一外源基因得以纯化与扩增。     

用琼脂糖凝胶制备电泳——冻融法纯化质粒DNA

随着基因工程研究的不断发展,DNA做为一种实验材料要求纯化方法更加简便,质量更高。目前关于质粒DNA的纯化方法已有许多报道。国外多采用氯化铯密度梯度离心法,国内则限于条件,很少应用此法。我们建立了琼脂糖制备电泳——冻融法,以纯化质粒DNA及DNA的酶切片段。方法简便易行,而且效果良好。     

戊型肝炎病毒结构区ORF2蛋白在巴氏毕赤酵母中的胞内表达与纯化的初步研究

为寻求新型表达系统来研制戊型肝炎基因工程疫苗 ,利用甲醇营养型酵母 pichiapastoris表达系统表达戊型肝炎病毒 (HEV)结构区ORF2蛋白。采用PCR方法从HEVcDNA中扩增得到的ORF2基因克隆到酵母表达载体pPIC3.5K上 ,构建成重组质粒 pPIC3.5KORF2。该质粒转化酵母菌GS115 ,经G418筛选得到高拷贝转化子。转化菌株经Mut表型鉴定后 ,用含甲醇的培养基诱导表达 ,SDS PAGE及ELISA筛选高表达活性菌株 ,放大培养后进行亲合层析纯化。在该系统中成功地表达了高生物活性的HEVORF2蛋白 ,经亲和层析纯化后扫描分析重组蛋白分子量约为 5 9kD ,纯度可达 96 %。Westernblotting证实 ,它与HEVORF2单克隆抗体有特异性反应。HEV结构区ORF2蛋白在甲醇营养型酵母中的成功表达 ,以及初步纯化得到的具有强免疫学活性的重组蛋白 ,为研制新型戊型肝炎基因工程疫苗奠定了基础     

比生长速率与培养基成份对rIL-2工程菌生长和表达的影响

基因工程菌高密度培养对提高单位体积培养物的产量,提高生产能力,减轻下游负担均有积极意义。本文对由PL-λCI_(857)温度诱导控制系统控制的rIL 2工程菌的高密度培养,及在高密度时实现较高表达的方案进行了初步研究。发现该菌的高密度生长时有乙酸积累,在升温诱导后乙酸积累加快,乙酸的存在对菌体生长和产物表达均有明显的抑制作用,这种抑制     

重组白细胞介素2体外折叠的实验研究

包涵体中的重组蛋白抽提后可以在变性状态下纯化,而纯化后的体外折叠（即复性）是基因工程下游处埋中的重要环节。荧光光谱研究表明,ＩＬ－２分子折叠过程中荧光强度逐渐减小,最大发射峰由３１６ｎｍ红移到３４８ｎｍ。以Ｔｒｐ残基的暴露程度反映分子的折叠状态。ＧＭ－ＣＳＦ在折叠过程中的荧光强度有类似变化;凝胶排阻ＨＰＬＣ可以检测折叠过程中的聚合体;而反相ＨＰＬＣ可以将ＩＬ－２分成三个相互独立的异构体色谱峰。据此可以计算出ＩＬ－２分子的正确折叠率。常用的稀释复性方法,随着ＩＬ－２浓度的增高,它的正确折叠率逐渐降低,蛋白浓度的对数与正确折叠率之间大致呈线性关系。当ＩＬ－２浓度为１ｍｇ／ｍＬ时,其正确折叠率仅为３０％,而采取较低的蛋白浓度进行复性会因大量的样品体积导致后期纯化的困难。     

关于幽门螺杆菌疫苗及其相关性研究的报告

幽门螺杆菌感染是慢性胃炎、消化性溃疡的主要致病因素,并且与胃癌的发生有关。本文报告了幽门螺杆菌疫苗及其相关性研究的成果,包括细菌的分离培养、毒力基因分型、抗原的纯化及单克隆抗体的研制、动物模型的建立及其基因工程株的构建等。     

人卵巢颗粒细胞的体外培养方法探讨

目的建立人卵巢颗粒细胞分离纯化、体外培养的有效方法。方法收集体外受精—胚胎移植(IVF-ET)穿卵时的卵泡液,用胰蛋白酶消化法及密度梯度离心法分离纯化颗粒细胞并用不同培养基进行培养。结果用体积分数为50%的Percoll细胞分离液分离,DMEM/F12或McCoy’5a液体培养基进行培养,细胞纯度高,存活率高,后续生长良好。结论建立了人卵巢颗粒细胞体外培养的稳定模型,为颗粒细胞的体外研究奠定良好的基础。     

工程大肠杆菌K99抗原蛋白的分离纯化及其特性的研究

本工作采用了快速、简便的方法从大量培养的基因工程菌E.coil 1548(pHK99)表面分离和纯化了K99抗原蛋白,纯化产物在SDS-PAGE上呈现-条蛋白带,该蛋白的分子量约为16500,PAS反应结果表明该蛋白为糖最白,等电聚焦证实该蛋白pI为9．5,用免疫学方法证实了该蛋白大量存在于细菌表面,并具有较好的热稳定性,文中还讨论了该蛋白在不同培养基中的表达。     

重组白细胞介素2体外折叠的实验研究

包涵体中的重组蛋白贩提后可以在变性状态下纯化,而纯化后的体外折叠（即复性）是基因工程下处理中的重要环节。荧光光谱研究表明,ＩＬ－２分子折叠过程中荧光强度逐渐减小,最大发射峰由３１６ｎｍ红移到３４８ｎｍ。以Ｔｒｐ残基的暴露程序反映分子的折叠状态,ＧＭ－ＣＳＦ在折叠过程中的荧光强度有类似变化,凝胶排阻ＨＰＬＣ可以检测折叠过程中的聚合体,而反相ＨＰＬＣ可以将ＩＬ－２分成三个相互独立的异构体色谱峰,据此可     

连续流层析技术在亲和层析中的应用及生产放大评估

生物制药行业迅速发展,尤其是上游表达量的增加和规模的扩大,促使上游培养采用连续灌流方式,同时也推动了下游纯化生产工艺相应的采取连续纯化策略。以灌流培养的Fc融合蛋白为例,采用 BioSMB PD设备,对比了下游工艺亲和层析捕获步骤中单柱批次纯化和连续流层析纯化的样品纯度和收率,并在此基础上进行小试工艺放大和生产实际用量成本计算评估。连续流层析实现了上游灌流培养与下游亲和层析连续化的可行性,工艺稳定,回收率与批次纯化接近,但相比批次纯化,生产效率明显提高,填料载量提高,同时填料使用效率提高,生产成本显著降低。     

基因工程乙肝病毒表面抗原纯化工艺研究

基因工程乙肝病毒表面抗原（ｒＨＢｓＡｇ）是由重组哺乳动物细胞ＣＨＯ系分泌表达的,经过纯化制备基因工程乙肝疫苗。目前在国际上,对从ＣＨＯ细胞培养液中分泌的ｒＨＢｓＡｇ,纯化工艺主要采用多步柱层析和超滤技术,而在国内,ＣＨＯ系ｒＨＢｓＡｇ的大规模生...     

肾综合征出血热疫苗研究进展

本文就肾综合征出血热纯化鼠脑灭活疫苗,细胞培养灭活疫苗和基因工程疫苗的研究和使用进展了综述。     

蛇毒锯鳞蝰素融合蛋白的发酵与纯化

研究大肠杆菌表达重组蛇毒锯鳞蝰素(Echistatin,Ecs)融合蛋白的发酵和纯化工艺。将Ecs基因插入表达载体pTXB1,转化E.coliBL21(DE3)构建工程菌。对工程菌进行补料分批培养并诱导表达,研究培养基、培养和诱导时间对工程菌生长和目的蛋白表达的影响,几丁质亲和层析纯化Ecs融合蛋白,经DTT裂解后,检测Ecs活性。发酵后菌体湿重可达75g/L,融合蛋白表达量约占总蛋白的35%,重组质粒在BL21宿主菌中传代稳定。亲和层析纯化后,得到Ecs单体,得率为28mg/L发酵液。生物学活性分析显示,重组Ecs能有效抑制血小板的聚集,其活性与天然Ecs相似。优化了Ecs融合基因工程菌的发酵和纯化条件,为规模化生产奠定基础。