基因重组Echistatin发酵工艺的优化

目的:利用基因工程方法对一种蛇毒锯鳞蝰素蛋白的发酵纯化工艺进行优化,以提高目的蛋白的产量和纯度。方法:对工程菌进行发酵培养并诱导表达,研究不同的培养基、不同补料方式、溶解氧浓度、培养和诱导时间对工程菌产量和目的蛋白表达量的影响,利用几丁质亲和层析纯化Ecs融合蛋白,通过合适温度和pH裂解融合蛋白得到Ecs纯品,并鉴定和检测Ecs活性。结果:经过高密度发酵优化后,菌体湿重可达110g/L,目的蛋白表达量约占总蛋白的40%;亲和层析纯化后,得到Ecs单体,得率为68mg/L发酵液。生物学活性分析显示,重组Ecs能有效抑制血小板的聚集,其活性与天然Ecs相似。结论:通过发酵和纯化工艺优化,大大提高了目的蛋白产量,为进一步规模化研究和生产奠定了基础。     

重组胸腺素α1的表达、纯化和生物学活性

为获得重组人胸腺素α1(recombinantthymosinα1,Tα1) ,采用融合表达方式表达Tα1基因 ,重组融合表达载体Tα1 pGEX 4XT 1转化大肠杆菌DE3(lys)构建工程菌 .对工程菌进行补料分批培养并诱导表达 ,得到目的蛋白的可溶性表达 .亲和层析纯化融合蛋白GST Tα1,经凝血酶裂解融合蛋白 ,亲和层析除去GST ,SourceQ离子交换 ,得到Tα1单体 ,得率为 30mg L发酵液 .生物学活性分析显示 ,重组Tα1能显著促进小鼠脾细胞增殖 (P <0 0 1) ,其活性与天然Tα1相似     

分泌型重组人生长激素工程菌发酵及其产物纯化

在 5L发酵罐中将工程菌pET-ompA3-hGH/BL21(DE3)进行补料式发酵 ,诱导表达分泌型重组人生长激素。通过对发酵培养基成分、补料成分、补料体积、补料时机和滴加流速的选择 ,分泌表达rhGH的量可达到 250mg/L ,占周质蛋白的 44%～ 54% ,发酵周期缩短为8h。用rhGH纯蛋白免疫动物制备的多克隆抗体制成的抗体亲和层析柱 ,一步纯化大肠杆菌周质中分泌表达的rhGH ,产物纯度达到96%以上 ,纯化产物在分子质量大小、免疫活性和二硫键的形成与天然生长激素相一致 。     

乙型肝炎病毒DNA聚合酶反式调节蛋白HBVDNAPTP1的表达、纯化与初步鉴定

目的构建HBVDNAPTP1基因的原核表达载体,诱导其在大肠埃希菌中表达,并对融合蛋白进行纯化。方法利用逆转录-PCR获得乙型肝炎病毒(HBV)DNA聚合酶(Polymerase)反式调节人类新基因HBVD-NAPTP1,测序正确后插入至原核表达载体pET-32a(+)中,转化BL21(DE3)宿主菌进行诱导,并利用组氨酸亲和层析方法对融合蛋白进行纯化。结果 HBVDNAPTP1原核表达载体转化宿主菌后,经0.5 mmol/L IPTG、30℃诱导5 h获得了分子量约为31 kD的HBVDNAPTP1融合蛋白的优化表达,Western blotting证实融合蛋白的特异性。亲和层析纯化后得到较纯的HBVDNAPTP1融合蛋白,每升培养菌液中可获得2.24 mg的纯化蛋白。结论成功获得纯化的HBVDNAPTP1融合蛋白,为今后开展HBVDNAPTP1的生物学功能研究奠定了物质基础。     

重组阳离子抗肿瘤肽AIK的原核表达、纯化及活性测定

利用Gateway克隆技术构建重组抗瘤肽AIK的原核表达体系,建立表达及纯化重组AIK的最优条件,为深入研究和利用AIK奠定基础。首先,设计含AttB重组位点的引物,通过重叠PCR技术扩增出Att B-TEV-FLAG-AIK序列,利用BP重组反应将目的序列TEV-FLAG-AIK克隆到供体载体pDONR223中,构建入门载体,再通过LR重组反应,将目的序列转移到目的载体pDEST15中,构建GST-AIK融合蛋白原核表达质粒。随后,在BL21(DE3)工程菌中优化诱导融合蛋白表达的条件。以谷胱甘肽磁珠纯化GST-AIK融合蛋白,再以rTEV酶切除GST,获得FLAG-AIK重组蛋白。最后以MTS法检测FLAG-AIK对白血病细胞HL-60的细胞毒性。菌液PCR验证和测序分析表明成功构建了重组抗瘤肽AIK的入门质粒和原核表达质粒。在BL21(DE3)工程菌中实现了GST-AIK融合蛋白的高效可溶性表达。并测得在37℃下以0.1 mmol/L IPTG诱导工程菌(OD600=1.0)4 h,重组蛋白表达量占菌体总蛋白的30%以上。经GST亲和层析、rTEV酶切除GST标签及二次GST亲和层析获得纯度高于95%的FLAG-AIK蛋白。MTS法测得所制备的FLAG-AIK蛋白抑瘤活性与化学合成的AIK相当。总之,本课题应用Gateway克隆系统成功构建了抗瘤肽AIK的原核表达质粒,实现了GST-AIK融合蛋白的高效可溶性表达,经亲和层析获得了有生物活性的重组AIK多肽,为后续深入研究和大规模制备奠定了基础。     

一种新型IIa类细菌素的克隆表达和活性鉴定

NB-C1为一种潜在的IIa类细菌素基因,为实现其在大肠杆菌中的高效可溶表达,首先构建了NB-C1蛋白与绿色荧光蛋白 (GFP) 的融合表达载体pIVEX 2.4d-GFP-NB-C1,然后将构建的表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3) pLysS,经诱导表达后,重组蛋白GFP-NB-C1以可溶的形式存在于细胞内。经Ni-NTA亲和层析柱分离纯化后,重组融合蛋白的纯度大于95％,产量达36.1 mg/L。抑菌试验表明,纯化后的重组蛋白对单核细胞增生李斯特氏菌具有明显的抑制作用。     

小鼠beta防御素2原核表达与抗菌作用的初步研究

构建小鼠β-防御素-2( mouse beta defensins 2,mBD2)原核表达质粒pET32/mBD2,进行蛋白诱导表达及纯化,测定并纯化蛋白的抗菌活性.旨在为选一步研究其生物学特性奠定基础.通过腹腔注射脂多糖(lipopoly-saccharide,LPS)建立小鼠急性时相反应,采用RT-PCR方法扩增mBD2成熟肽,经KpnⅠ和XhoⅠ双酶切后插入相同酶切的pET-32a(+)载体,构建的重组质粒.将鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌表达菌株BL21 (DE3),采用异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导融合蛋白的表达.通过镍亲和层析获得纯化的融合蛋白.将融合蛋白采用肠激酶酶切、洗脱并用滤纸片法测定目的蛋白的抗菌活性.成功构建了原核表达质粒pET32a(+)/mBD2,并转化工程菌BL21( DE3).在0.25 mmol/L IPTG、30℃诱导4h条件下获得的融合蛋白.采用抑菌试验证实蛋白具有一定的抑制革兰阳性菌及阴性菌生长的作用.本研究成功构建了pET32/mBD2原核表达质粒,得到了在大肠杆菌中稳定表达mBD2蛋白.     

抗菌肽Cec4a的重组表达和抗菌活性研究*

目的:构建Cec4a的原核重组表达体系,通过诱导表达、酶切纯化获得重组蛋白,并检测产物的抗菌活性。方法:基于Cec4a的序列设计引物,克隆Cec4a基因的DNA片段。利用原核表达载体(pCold-SUMO)构建重组原核表达质粒,并将其转化到大肠杆菌C41(DE3)等感受态细胞,使用IPTG进行诱导表达。通过Ni-NTA亲和层析柱纯化,获得含有His-SUMO标签的重组Cec4a融合蛋白。在SUMO蛋白酶酶切后,再次使用Ni-NTA亲和层析纯化,得到目的蛋白,最后用鲍曼不动杆菌(ATCC19606)作为指示菌检测表达产物的抗菌活性。结果:成功构建pCold-SUMO-Cec4a原核表达质粒,测序分析其序列与预期结果一致。Cec4a融合蛋白表达量为42.8mg/L,纯化后的Cec4a重组蛋白对鲍曼不动杆菌的MIC为4 μg/mL。结论:通过原核表达,并经Ni-NTA亲和层析纯化,获得了具有抗菌活性的重组蛋白Cec4a,为研究Cec4a的生物活性、抗菌机制及应用奠定了基础。     

重组人血小板生成素融合蛋白工程菌发酵工艺的研究

对表达重组人血小板生成素融合蛋白（rhTPO/GST)工程菌的发酵条件进行了较详细的研究,优化了影响工程菌发酵的条件,探讨了发酵条件对工程菌表达外源蛋白量的影响。结果发现采用复合培养基分阶段流加有机营养物,用异丙基硫代-B-D-半乳糖苷（IPTG）进行诱导,使rhTPO/GST融合蛋白的湿菌重达25g/L以上,表达水平约占菌体总蛋白的30%左右。在此基础上,建立了中试发酵生产工艺流程。     

乳糖诱导的重组人血管内皮抑素(rhEndostatin)蛋白的表达

研究用乳糖替代IPTG作为诱导剂进行重组蛋白的表达,观察乳糖对乳糖操纵子调控的基因工程菌发酵及重组血管内皮抑素表达的影响,从而选取最佳诱导表达条件。以重组人血管内皮抑素表达工程菌pETrhEN/BL21(DE3)作为研究对象,分别用IPTG和乳糖作为诱导剂,在摇瓶中进行表达实验。并对重组蛋白质表达量进行分析。然后在5 L发酵罐中进行验证。在摇瓶培养条件下,乳糖浓度大于0.5 g/L即可以诱导目的蛋白的表达。乳糖浓度1 g/L时诱导目的蛋白表达量与1 mmol/L的IPTG相当,当乳糖浓度为10 g/L,目的蛋白表达量达到最大。在发酵罐培养条件下,补料4 h后葡萄糖浓度基本耗尽,此时开始加入乳糖。诱导后1 h,即有重组蛋白表达,在诱导后4 h达到高峰(占菌体可溶性蛋白的56%),与此同时,诱导后5 h菌体浓度也达到最高值。在以乳糖操纵子为调控手段的工程菌表达系统中,可以使用乳糖作为诱导剂,诱导应在葡萄糖消耗完后进行。     

基因重组大肠杆菌表达HrpNEcc蛋白的发酵条件及诱导条件优化

对已构建好的表达HrpNEcc蛋白的工程菌BL21(DE3)/pET30a(+)hrpN Ecc的摇瓶发酵条件及乳糖诱导进行优化, 通过在7L发酵罐中放大发酵实验,以期提高蛋白产量并降低生产成本。在摇瓶中优化的发酵及诱导条件是：5% 的接种量,TB培养基,菌体培养至对数生长前期,添加3g/L外源诱导剂乳糖时,HrpNEcc蛋白产量可达417.60mg/L,比不添加乳糖时提高了36.73%,比用IPTG诱导时提高了16.85%。7L发酵罐中发酵,获得菌体湿重达到57.24g/L（WCW）,可溶性HrpNEcc蛋白产量占细胞总蛋白的50.2%,为3.29 g/L。     

Expression and purification of soluble B lymphocyte stimulator from recombinant Escherichia coli

In this work, the expression conditions of fusion protein thioredoxin (Trx)-soluble B lymphocyte stimulator (sBLyS) in shake flask and bioreactor from the recombinant Escherichia coli BL21 (DE3) with a pET system encoding the fusion protein gene of Trx-sBLyS and the purification method of the sBLyS were optimized to effectively obtain the bioactive protein sBLyS with a high purity. A yield of about 250 mg Trx-sBLyS/g DWC (1686 mg Trx-sBLyS/L) and expression level of about 38.5% in soluble Trx-sBLyS were obtained in a 30 1 bioreactor after optimization of the fermentation conditions. After the completion of the optimized purification procedure in order of affinity chromatography, enzymatic cleavage with enterokinase and DEAE ion exchange chromatography, about 200 mg sBLyS per liter fermentation broth was obtained with a purity of about 95% and a yield of near 30%, respectively. Furthermore, the molecular weight (MW) and the isoelectric point (pI) of the purified sBLyS were determined by 2-D gel electrophoresis and SDS-PAGE analysis and estimated to be over 16 kDa and about pH 4.15, respectively. In addition, the bioactivities of the soluble Trx-sBLyS in fermentation broth and the purified sBLyS were tested by two kinds of analytical methods of bioactivity. The good fermentation yield and the satisfied, purified sBLyS product with high purity, yield and bioactivity demonstrated the sBLyS production procedure was promising in industry.     

腈水解酶psn基因工程菌的发酵及产酶条件优化

来自恶臭假单胞菌的腈水解酶具有高效催化3-氰基吡啶产烟酸的能力,对表达该酶的基因psn进行发酵和产酶条件优化,通过对C源、N源、磷酸盐、金属离子、温度、诱导剂浓度和诱导时间进行单因素考察,获得最适培养基条件(g/L):葡萄糖5、蛋白胨15、酵母粉5、(NH4)2SO45、K2HPO424.5、KH2PO45.76、MgSO40.48;最佳诱导条件:培养2.5 h后添加IPTG诱导,浓度0.2 mmol/L,诱导温度30℃。在该条件下培养,重组大肠杆菌的腈水解酶比酶活可达到45.67 U/mL,比优化前提高了2.26倍。在此基础上,于5 L发酵罐上进行C、N源的补料研究,获得最适分批补料策略,发现其腈水解酶活力可达到75.40 U/mL,是优化前的3.74倍。     

APOBEC3G蛋白的原核表达及纯化

目的：原核表达重组APOBEC3G蛋白,为其功能及免疫原性研究奠定基础。方法：提取H9细胞全细胞基因组RNA,通过RT-PCR获得目的基因,经纯化、酶切后克隆到原核表达载体pET32a中,转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株获得表达工程菌株,并对表达条件和纯化条件进行优化;利用Western Blot分析鉴定目的蛋白。结果：构建了APOBEC3G蛋白的原核表达载体Apo-His-pET32a,并在大肠杆菌中获得高表达,目的蛋白以可溶性蛋白形式存在;经Ni-NTA亲和层析柱一步纯化,获得了高纯度的重组APOBEC3G蛋白,蛋白浓度可达1．2mg／mL;Westem Blot显示获得了目的蛋白。结论：在原核表达系统中表达、纯化了可溶性APOBEC3G蛋白,为进一步对其进行免疫原性和功能研究奠定了基础。     

表达重组人骨形态发生蛋白-7工程菌的发酵及表达产物的纯化

目的:研究表达重组人骨形态发生蛋白-7工程菌的发酵和表达产物的纯化工艺。方法:利用16L发酵罐发酵培养工程菌,设定了溶氧、搅拌速度、诱导时机、补料和培养基pH值等发酵条件;通过包涵体洗涤、离子交换层析法纯化目的蛋白。结果:工程菌目的蛋白质表达量占菌体总蛋白质的30%以上,纯化后目的蛋白的纯度可达98%。结论:建立了大肠杆菌高效表达人骨形态发生蛋白-7的发酵及纯化工艺。     

磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C的异源表达和应用

旨在研究大肠杆菌产磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)的发酵表达和分离纯化,探究PI-PLC酶切GPI锚定蛋白的效果。依据NCBI数据库中蜡样芽孢杆菌的PI-PLC的基因序列,按照大肠杆菌的密码子偏好性进行密码子优化,合成相应基因序列并构建基因表达载体pGEX-6P-1-PI-PLC。将重组质粒转入受体菌E.coli BL21(DE3)中,通过加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导目的基因PI-PLC表达。经检测,含有GST标签的PI-PLC融合蛋白以可溶蛋白形式存在于菌体破碎上清,分子量约为61 kDa,与预期相符。初步优化诱导表达条件后,发现最佳诱导表达条件为:以接种量5%接种体积分数接种,待菌体生长至OD600nm达到0.5,在16℃条件下以0.3 mmol/L浓度IPTG诱导24 h。利用GST标签对蛋白进行纯化,纯化后的PI-PLC质量浓度为0.52 mg/mL,比酶活为1322.5 U/mg。利用PI-PLC酶液对哺乳动物细胞表面的模式GPI锚定蛋白CD59进行酶切,酶切作用显著。因此,下一步可以将PI-PLC融合蛋白应用于细胞生物学中对GPI-APs的研究和鉴定。     

High-level expression in Escherichia coli of a chemically synthesized gene for [Leu-28]echistatin

A gene (Ecs) encoding a platelet aggregation inhibitor, echistatin (Ecs), has been chemically synthesized. Met at position 28 of the native protein was replaced by Leu in the recombinant Ecs. To express this synthetic gene in Escherichia coli, an expression vector, pJC264, was constructed by inserting portions of the E. coli cheB and cheY gene complex into the plasmid pUC13. High-level expression of the synthetic [Leu-28]Ecs was achieved by its fusion with the E. coli cheY gene in the expression vector. Recombinant [Leu-28]Ecs was liberated from the fusion protein by CNBr cleavage at the Met inserted between the CheY protein and [Leu-28]Ecs. The recombinant [Leu-28]Ecs was purified to homogeneity by reverse-phase high-performance liquid chromatography. The refolded [Leu-28]Ecs was identical to native Ecs in inhibiting platelet aggregation, suggesting that Met at position 28 is not essential for the biological activity of this platelet aggregation inhibitor.     

自噬相关基因Atg5的原核表达及多克隆抗体制备

目的：克隆自噬相关基因Atg5,在大肠杆菌中重组表达后制备抗Atg5多克隆抗体。方法：用RT-PCR方法从RAW264．7细胞基因组中克隆Atg5基因,连接至pQE80L原核表达载体后转化大肠杆菌DH50α进行诱导表达,SDS-PAGE及Westernblot鉴定表达蛋白;目的蛋白纯化后,以100μg／kg纯化的蛋白免疫新西兰兔,制备抗Atg5多克隆抗体;提取RAW264．7细胞总蛋白,以制备的抗Atg5多抗进行Westernblot反应,检测多抗的生物学活性。结果：克隆了Atg5基因,在大肠杆菌中表达了重组Atg5,SDS-PAGE分析显示表达产物相对分子质量与预期值一致,Western blot结果证明该产物具有较高的生物学活性,纯化蛋白免疫动物后制备了抗Atg5多克隆抗体。结论：在大肠杆菌中表达了重组Atg5,制备了抗Atg5多克隆抗体,为自噬的检测和研究提供了工具。     

脯氨酰内肽酶培养条件的优化及高密度发酵

基因工程菌E.coliBL21/pGEMPEP可以组成型表达重组的点状产气单胞菌脯氨酰内肽酶(PEP),但培养条件极大地影响着酶的产量,为了获得高效表达,首先测定了工程菌表达PEP的稳定性并考察了培养温度、pH、发酵时间、碳源、氮源、无机盐等对产酶的影响,得到了优化的发酵条件,L9(3⁴)正交试验进一步明确了摇床转速、培养温度、pH值、培养时间对产酶量的影响都有高度的统计学意义。在此基础上利用NBSBioFlo3000型5L自控发酵罐进行了高密度、高表达发酵、经20h培养,最终菌体密度达OD₆₀₀60(相当于干菌体225g/L),PEP表达量为28%,每升发酵液中含PEP酶315g。