快速制备酵母质粒和基因组DNA PCR模板

发展了一个利用煮沸法快速制备酵母质粒和基因组DNA PCR模板的程序,成功地从低拷贝的ARSCEN酵母质粒和酵母基因组扩增到了相应基因。     

利用微波炉快速制备酵母质粒和基因组DNA PCR模板

制备基因组ＤＮＡＰＣＲ模板一般都比较费工费时 ,研究人员尝试用微波炉提取真核生物基因组ＤＮＡ ,然后做ＰＣＲ扩增取得了较好的效果[1 ,2 ] 。本文描述了一个利用微波炉快速制备酵母质粒和基因组ＤＮＡＰＣＲ模板的程序 ,具有良好的重复性。1　材料与方法1.1　材料酿酒酵母菌种 1ｃ163 6ｄａｒｇ11,ｕｒａ 3为比利时ＯｒｉａｎｅＳｏｅｔｅｎｓ馈赠。酵母载体ｐＹＸ13 3从美国康乃尔大学曹维国处获得 ,并由此构建了粗糙脉孢霉ａｒｇ 13ｃＤＮＡ的酵母表达载体ｐＹＸＡ5。培养基为ＳＤ或ＹＰＤ固体培养基。1.2　酵母质粒提取[3]取 1.5ｍｌ…     

圆红冬孢酵母自主复制序列分离和利用游离型质粒进行基因敲除

【目的】与整合型表达载体相比,游离型表达载体通常具有更高的拷贝数以实现目标基因的高强度表达,并且对于DNA操作应用更加方便和灵活。然而,目前的研究尚未确定适用于圆红冬孢酵母的游离型质粒,该酵母外源基因的表达或者基于CRISPR/Cas9的基因组编辑都需要通过整合方式来完成,这也是对其遗传改造进展缓慢的一个重要原因。本研究目的是构建圆红冬孢酵母的游离型质粒,使得其外源基因的表达和基因组编辑更方便省时。【方法】首先对圆红冬孢酵母苯丙氨酸氨裂解酶基因(phenylalanine ammonia-lyase gene, PAL)中可能存在的自主复制序列(autonomously replicating sequences, ARSs)进行挖掘和表征,将该基因及其上下游序列进行分段扩增,构建到带有β-异丙基苹果酸脱氢酶基因(β-isopropyl malate dehydrogenase gene, LEU2)的质粒中,通过电转化的方法导入LEU2基因缺陷的圆红冬孢酵母中,根据转化效率高低鉴定了该酵母的一个ARS。其次,以编码香叶基香叶基焦磷酸合成酶(geranylgeranyl pyrophosphate synthase, GGPPS)的BTS1基因为敲除靶点,将其gRNA构建到基于ARS的游离型质粒中,通过转化子直观的颜色变化来验证该游离型质粒是否成功应用于圆红冬孢酵母的CRISPR/Cas9体系。【结果】本工作鉴定了圆红冬孢酵母的ARS,构建了基于ARS元件的游离型质粒,并将该质粒应用于圆红冬孢酵母CRISPR/Cas9体系,成功实现了基于游离型质粒的基因敲除。【结论】本研究丰富了圆红冬孢酵母现有的工具库,为圆红冬孢酵母的合成生物学应用提供了良好的研究基础和技术支持。     

戊型肝炎病毒开放读框2的克隆及表达载体的构建

戊型肝炎病毒（HEV）为单股正链RNA病毒,整个基因组有3个开放性阅读框架（ORF）,ORF2（全长约1.98kb）是主要结构基因编码区。将经过PCR获得的ORF2基因插入非分泌型酵母穿梭质粒pPIC3,构成受醇氧化酶（AOX2）的启动子与转录终止区控制的酵母表达质粒,重组质粒经酶切线性化后转化酵母细胞GS115,经过鉴定可挑取与酵母染色体发生交换的重组体,用于进一步的真核表达。     

猪β防御素2成熟肽在酵母中的表达

【目的】将猪β防御素2成熟肽基因片段正确整合到酵母基因组染色体上,从而得到稳定的猪β防御素2成熟肽的毕赤酵母表达株。实现猪β防御素2成熟肽的表达。【方法】首先参考酵母偏爱密码子,设计3段引物序列,利用PCR技术扩增得到β防御2成熟肽基因,构建了重组质粒pPIC9k-GST-pBD-2和pPIC9k-pBD-2。将线性化的重组质粒电转化到毕赤酵母KM71细胞中。最后筛选得到酵母阳性克隆,通过不断调节表达条件,实现猪β防御素2成熟肽的表达。【结果】将GST-pBD-2基因序列和pBD-2基因序列分别成功整合到酵母KM71基因组中,重组毕赤酵母工程菌构建成功;重组酵母蛋白GST-pBD-2和PBD-2都成功获得了表达;PBD-2成熟肽表达上清对猪霍乱沙门氏菌弱毒株C500有一定的抑制作用。【结论】获得表达pBD-2成熟肽的酵母菌株,本实验是用真核细胞表达pBD-2成熟肽的一次探索,为后续大量表达pBD-2成熟肽方法的研究打下了基础。     

黑曲霉木聚糖酶在工业酒精酵母中的分泌表达

用重叠延伸PCR方法从黑曲霉 (Aspergillusniger)UV 11的基因组DNA中克隆出木聚糖酶的cDNA基因 ,构建了由酵母乙醇脱氢酶 (ADH1)启动子和终止子引导表达、木聚糖酶自身信号肽引导分泌、rDNA序列介导的酵母整合型分泌表达质粒pAX2。用pAX2与酵母YEp型G4 18抗性质粒共转化野生型工业酒精酵母S .cerevisiae 2 346 ,获得了整合型分泌表达木聚糖酶的酵母重组菌株XY2。发酵分析表明该工程菌能够明显提高酒精生产率     

酵母Bir1p同源物Survivin对毕赤酵母的分子重组与生长影响

Bir1p是酵母凋亡途径中抑制细胞凋亡的重要蛋白,Survivin是Bir1p的人源同源物,Survivin第34位氨基酸T向A的突变能使其功能逆转.将Survivin及其突变体Survivin(T34A)的基因分别构建到组成型穿梭表达质粒pGAPZA中,整合入毕赤酵母的基因组,分析对酵母细胞凋亡的影响.酵母生长曲线、MTT及流式细胞仪测定数据显示,Survivin和其突变体基因在酵母中的表达分别抑制和促进了酵母凋亡.多样的工艺对工业用酵母的凋亡提出了不同的要求,本研究为工程酵母的理性改造提供了理论依据.     

B型肝炎病毒表面抗原颗粒在酵母中的合成和装配

用一个表达型质粒在酵母中合成了B型肝炎病毒的表面抗原(HB_sAg)),其载体利用酵母酒精脱氢酶15′边侧区域作为启动子转录HB_sAg的编码顺序。在酵母中合成的蛋白质被装配成颗粒,具有的特性类似人类细胞所分泌的22μm颗粒。 B型肝炎病毒是由一个含有病毒基因组(部分为单链的约3200bp长的DNA)的核结     

限制酶介导整合技术：一种克隆新基因的新策略

限制酶介导整合（REMI）技术是近年发展起来的一种研究新基因的方法,已被用于盘基网柄菌、酵母和丝状真菌等微生物细胞与发育过程的研究。结合质粒拯救技术,可快速分离质粒两侧未知的基因组DNA序列,进而对该序列做进一步分析和研究。我们简要介绍了REMI技术的基本原理、影响因素、缺点及其应用。     

甘露聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达及酶学性质研究

采用PCR的方法,以枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis基因组 DNA 为模板,克隆出甘露聚糖酶MAN的成熟肽编码序列,将其插入巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris表达载体pPIC9K中,并位于α-因子信号肽序列的下游,获得重组质粒pPIC9K-MAN。重组质粒线性化后用聚乙二醇法导入毕赤酵母Pichia pastoris菌株GS115中,经大量筛选,获得高效分泌表达甘露聚糖酶的毕赤酵母工程菌株MAN22。将此菌株在5 L发酵罐中进行高密度发酵,测定酶活最高达1102IU /mL,同时对重组甘露聚糖酶的性质进行了初步研究。     

米根霉糖化酶、类芽孢杆菌木聚糖酶融合蛋白的真核分泌表达

以米根霉(Rhizopus oryzae)3.866基因组DNA为模板,克隆得到糖化酶基因(glucoamylase gene, amyA),基因全长2 049 bp,编码604个氨基酸;以类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)H10-3基因组DNA为模板,克隆出基因木聚糖酶基因(xylanase A gene, xynA)的成熟肽编码序列,长636 bp,编码211个氨基酸。通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)得到拼接片段amyA-l-xynA,并将其克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9中,得到重组质粒pPIC9-amyA-l-xynA,重组质粒线性化后经电击转化到毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中,得到了表达成功的工程菌AX11。在AX11发酵上清液中同时检测到糖化酶活性(5.8 U/mL)和木聚糖酶活性(32.3 U/mL)。     

酿酒酵母全基因组SNARE蛋白的亚细胞定位研究

在真核细胞中,内质网、高尔基体、质膜等膜结构间的蛋白质运输主要通过囊泡出芽和融合实现。SNARE蛋白家族在介导囊泡与目的膜结构融合过程中发挥关键作用。在模式生物酿酒酵母中,对全基因组SNARE蛋白的系统研究仍有不足。此研究构建了一套用于标记酿酒酵母基因组全部24种SNARE的工具质粒。该系列质粒既能呈现出良好的定位特征,又避免了过度表达造成的定位异常。通过与细胞器标记共定位验证了SNARE蛋白的亚细胞定位。结果发现3种SNARE的定位与之前报道不符:Bos1定位于早高尔基体,Snc1和Bet1定位于晚高尔基体/早内体。另外,Sec9定位于芽尖和芽颈,这是首次观察到Sec9在活酵母细胞中的定位。这项工作首次全面的检验了酵母SNARE家族蛋白的亚细胞定位,为后续SNARE蛋白功能研究提供了新线索,并为相关研究提供了一套工具质粒。     

菊粉酶基因在酿酒酵母中的表达及乙醇发酵

以乙醇耐受力较强的酿酒酵母为受体菌,构建了能够分泌菊粉酶的基因工程菌并进行了菊芋粉的生料发酵。首先,以马克斯克鲁维酵母Kluyveromyces marxianus中的基因组DNA为模板,PCR扩增菊粉酶编码基因inu,分别使用菊粉酶自身启动子和酵母磷酸甘油激酶 (Phosphoglycerate kinase,pgk) 启动子,构建重组表达质粒HO/p-inu和HO/pgk-inu。经NotⅠ线性化后,采用电击法转化酿酒酵母工业菌株Saccharomyces cerevisiae 6525,分别得到含菊     

α-乙酰乳酸脱羧酶在毕赤酵母中的分泌表达

根据已知的α-乙酰乳酸脱羧酶（ALDC）基因序列,通过PCR从枯草杆菌168基因组上扩增得到编码ALDC的结构基因。将该基因克隆到大肠杆菌一毕赤酵母穿梭载体pPIC9中,构建了重组质粒pPIC9-ALDC,电击转化毕赤酵母GS115。在甲醇诱导下,毕赤酵母分泌表达了ALDC。SDS—PAGE分析可见到Mr约62000的表达条带,经测定,表达产物活力为0．03U／mL。     

一种简便的适用于酵母双杂交系统的酵母质粒提取方法

目的:建立一种适用于酵母双杂交系统的简便快捷的酵母质粒提取方法。方法:以酿酒酵母为供试材料,用玻璃珠振荡法破除酵母细胞壁,提取酵母总DNA,最后通过电转化大肠杆菌DH10B获得目的质粒。结果:粗提得到的质粒可直接转化DH10B,作为模板用于PCR分析及酵母双杂交后续的序列分析等,大大降低了工作量。结论:该方法简便快捷,经济实用,降低了成本,提高了效率,可以作为一种实验室酵母质粒提取方法。     

肠道病毒71型3D聚合酶转录激活域的界定

EV71是导致手足口病的主要病原体之一,其3D聚合酶作为依赖于RNA的RNA聚合酶,在病毒基因组转录及复制过程中发挥重要作用。当前,3D与宿主细胞的相互作用鲜有研究。酵母双杂交实验是研究蛋白质相互作用成熟有效的方法。本文将3D基因克隆至pGBKT7载体,构建了用于酵母双杂交实验的诱饵质粒,鉴定正确后转化酵母细胞AH109,依次检测了3D蛋白的表达、细胞毒性和自激活能力,结果表明3D基因可在AH109菌株中表达,对后者生长无显著影响,但融合蛋白具有自激活能力。进一步构建一系列含3D蛋白截短体的诱饵质粒,通过自激活实验界定了3D的最小转录激活域(1~94aa),为后续利用酵母双杂交技术研究与3D相互作用的细胞蛋白奠定了基础。     

牛凝乳酶基因在毕赤酵母中的重组表达

通过PCR技术从克隆载体pMD18T-Prochy上扩增牛凝乳酶原基因,双酶切后定向插入到酵母表达载体pPICZaA中,构建表达质粒pPICZaA-Prochy,线性化后电转化毕赤酵母GS115,经PCR和测序鉴定凝乳酶原基因成功插入到毕赤酵母的基因组中。在甲醇诱导下进行凝乳酶的表达,SDS-PAGE分析证明重组凝乳酶的分子量约为37 kD,培养基上清液中凝乳酶的活性为12.2 SU/mL。本研究首次应用毕赤酵母表达牛凝乳酶,在培养基中获得分泌表达的重组凝乳酶,为干酪工业提供了新型及优良的凝乳酶来源。     

高质量毕赤酵母基因组DNA提取方法比较

旨在比较5种毕赤酵母基因组DNA的提取法,以便获得简便高效的提取高质量酵母基因组DNA的优化方法。分别使用蜗牛酶破壁法,超声波破碎法,液氮研磨法,Lyticase破壁法,试剂盒法提取毕赤酵母基因组DNA,然后进行DNA电泳检测以及紫外分光光度计测定DNA浓度和纯度。结果显示,5种方法均能提取出酵母基因组DNA,而酶法所提取的酵母基因组DNA质量最好。由此证实,蜗牛酶法成本低、效果好,是理想的提取高质量酵母基因组DNA的方法,完全满足后续试验要求。     

一种简便高效的酵母基因组提取方法

提取基因组进行检测是酵母研究过程中的必要步骤之一。以毕赤酵母菌株GS115作为研究对象,主要成分为0.2 mol/L醋酸锂和1% SDS的酵母裂解液能高效的裂解酵母细胞壁。与两种酵母基因组提取试剂盒相比,该方法从相同体积的酵母培养液中获得的基因组的量高5倍以上,并且操作简便、快速,能在2 h内完成一次提取过程,极大地缩短了时间。以GS115中的内源AOX基因为目的基因,对提取的基因组进行PCR检测和Southern杂交检测,进一步验证了基因组的质量。因此,本文建立了一种简便、快速、经济而高效的酵母基因提取方法。     

一种快速、有效、经济的提取酵母质粒的方法

目的：建立一种经济有效、快速简便、稳定的提取酵母质粒的方法。方法：用葡糖苷酸酶消化酵母细胞壁以获取原生质体,然后采用碱裂解法裂解原生质体以获得质粒。结果：与采用商品化离心柱法试剂盒所提取的质粒相比,用该法获取的酵母质粒在PCR分析及转化效果方面没有差异。结论：建立了一种经济有效、快速简便、稳定的提取酵母质粒的方法。