不同分泌信号对豹蛙酶在巴斯德毕赤酵母中分泌效率的影响

目的：研究不同分泌信号对豹蛙酶（ONC）在巴斯德毕赤酵母中分泌效率的影响。方法：根据已知天然ONC的氨基酸序列,结合酵母偏爱密码子,设计并合成了ONC基因序列,通过融合PCR获得了不同分泌信号与ONC的融合基因,将其克隆至表达载体pPIC9k中,然后将线性化的重组表达载体电击转化GS115毕赤酵母感受态细胞,通过SDS-PAGE检测目的蛋白表达量。结果：糖基化ONC表观相对分子质量为（14～16）×103,且其糖基化不均匀,非糖基化蛋白肽链的相对分子质量约为12×103;采用不含EAEA结构的α交配因子作为分泌信号时ONC没有表达,利用含EAEA结构的α交配因子和α交配因子的pre肽作为分泌信号时均能够显著提高其表达量。结论：采用含EAEA结构的α交配因子和α交配因子的pre肽作为分泌信号均能够显著提高ONC在巴斯德毕赤酵母中的表达量。     

分子伴侣对可溶性肿瘤坏死因子相关促凋亡配体在巴斯德毕赤酵母中表达的影响

目的:提高外源蛋白可溶性肿瘤坏死因子相关促凋亡配体(sTRAIL)在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达。方法:根据GenBank公共数据库中公布的模式生物酿酒酵母的分子伴侣(Ssa1p、YDJ1、Kar2p和PDI)基因序列设计引物,利用PCR方法从酿酒酵母基因组中得到各基因片段,并将单独Ssa1p或Kar2p、组合YDJ1 PDI、Kar2p PDI或YDJ1 PDI PDI分别构建到pPIB2Z表达载体中,并整合到外源蛋白sTRAIL工程菌(毕赤酵母GS115)中进行筛选和诱导表达。结果:SDS-PAGE分析表明,sTRAIL的表达量明显提高,特别是整合了分子伴侣组合YDJ1 PDI的工程菌。Western印迹分析整合的分子伴侣基因后,分子伴侣蛋白在工程菌中的表达量得到了提高。结论:提高细胞内分子伴侣的表达,可以增加外源蛋白的分泌表达,为进一步研究巴斯德毕赤酵母奠定了基础。     

PCR克隆新基因策略研究进展

自从PCR被开发及其基本反应条件被优化以来,这项技术已被应用于分子生物学研究的各个方面。其中应用最多的是从给定的有机体中扩增和克隆新基因：那些从事新基因的结构和功能分析研究的工作者必须获得第一手资料,也就是新基因的序列。而且快速方便地克隆这些新基因序列在很大程度上依赖于那些由PCR技术演变而来的方法。本文综述概括了建立在PCR基础上的方法在新基因分离克隆中的各种应用.     

巴斯德毕赤酵母表达系统中甘油阻遏相关基因GR1的分离克隆与鉴定

目的：分离克隆并鉴定巴斯德毕赤酵母表达系统中甘油阻遏相关基因。方法：PCR扩增LacZ基因,克隆至pPLC9载体,构建pPIC9-LacZ表达载体,经Sal I线性化后转化巴斯德毕赤酵母GS115,构建GS115-LacZ模式菌株;用限制酶介导整合（REMI）技术使GS115-LacZ菌体基因组产生随机突变,筛选甘油去阻遏的GS115-LacZ△菌体;Southern blot鉴定GS115-LacZ△基因组,用质粒拯救技术和TAIL-PCR克隆未知基因序列并测序。结果：得到甘油去阻遏的GS115-LacZ△菌体,经Southern blot分析,突变仅发生在1个基因中;通过质粒拯救和TAIL-PCR,分离得到阻遏相关基因GR1,共2863bp,经在线BLAST,发现其编码一种过氧化物酶体自吞噬相关蛋白。结论：分离得到阻遏相关基因GR1,与过氧化物酶体自吞噬相关,提示过氧化物酶体自吞噬相关基因可能对醇氧化酶启动子AOX1的转录活性有影响。     

限制酶介导整合技术：一种克隆新基因的新策略

限制酶介导整合（REMI）技术是近年发展起来的一种研究新基因的方法,已被用于盘基网柄菌、酵母和丝状真菌等微生物细胞与发育过程的研究。结合质粒拯救技术,可快速分离质粒两侧未知的基因组DNA序列,进而对该序列做进一步分析和研究。我们简要介绍了REMI技术的基本原理、影响因素、缺点及其应用。