协同激活分子CBP诱饵表达质粒的构建和鉴定

构建协同激活分子CBP（CREB（cAMP response element binding）binding protein）的诱饵表达质粒pGBKT7-CBP并检测其蛋白表达、毒性和自激活作用.PCR扩增小鼠CBP的基因编码序列（CDS（coding sequence）序列）并克隆入诱饵表达载体pGBKT7中,通过酶切和测序鉴定后,把构建好的诱饵表达质粒pGBKT7-CBP转化到酵母AH109细胞中,Western blot检测诱饵蛋白表达情况,同时检测诱饵蛋白的毒性和自激活作用.结果成功扩增了小鼠CBP基因的CDS序列,并成功克隆到酵母诱饵表达载体pGBKT7中,测序结果正确.诱饵表达质粒成功转化到酵母AH109细胞中,Western blot分析结果证实酵母细胞高表达诱饵蛋白CBP,但诱饵蛋白有自激活作用.提示pGBKT7-CBP不能用于酵母双杂交或三杂交系统检测CBP与其他蛋白质或小分子的相互作用,对其他研究CBP生物学功能试验的方法选取具有一定的借鉴意义.     

早幼粒细胞白血病基因结构域诱饵载体的构建及鉴定

目的研究早幼粒细胞白血病基因（promyelocytic leukemia,PML）中含环指／B—BOX结构与含coiled—coil结构的两个结构域的功能,构建含其结构域序列的诱饵表达载体,为进一步应用酵母双杂交系统筛选与之相互作用的蛋白建立实验基础。方法PCR扩增PML的两个结构域序列,克隆人诱饵载体pG—BKT7中,经测序鉴定后,将诱饵载体转化到酵母细胞AH109中,检测诱饵蛋白有无毒性,渗漏和自激活作用,同时利用蛋白印迹法分析诱饵蛋白的表达。结果成功扩增了PML两个结构域的基因片段,并正确克隆入pGBKT7中。诱饵载体成功转化到酵母细胞AH109中,其中一个诱饵蛋白BD—PML—B无毒性,但具有渗漏和自激活作用,另一个诱饵蛋白BD—PML—C无毒性,渗漏和自激活作用,蛋白印迹法分析证实酵母细胞表达诱饵蛋白。结论含环指／B—BOX的结构域具有转录因子活性,全长PML的转录活性与之有关;成功构建了含coiled—coil结构的PML结合域的酵母诱饵表达载体,为运用酵母双杂交技术筛选与之作用的蛋白并探讨其功能奠定了基础。     

抗增殖蛋白在酵母双杂交系统中转录激活作用的检测

目的:检测抗增殖蛋白在酵母双杂交系统中是否具有转录自激活作用。方法:采用PCR方法扩增抗增殖蛋白基因全长序列,构建酵母双杂交系统的诱饵载体pGBKT7-PHB,制备酵母菌AH109感受态细胞,将pGBKT7-PHB转化感受态酵母菌AH109后培养于含缺失培养基的平板上,检测β-半乳糖苷酶活性,判定其是否具有转录自激活作用。结果:扩增出抗增殖蛋白基因全长序列,构建了诱饵载体pGBKT7-PHB,转化酵母菌AH109后在双缺和三缺培养基上未能使β-半乳糖苷酶活性滤纸片变蓝,说明报告基因未被激活。结论:抗增殖蛋白没有转录自激活作用,可用于酵母双杂交系统。     

HCV截短型E2蛋白在酵母双杂交系统中的表达及自激活作用检测

目的：获得不包含C末端跨膜区的HCV包膜糖蛋白E2蛋白（E2 661）编码基因,构建酵母双杂交诱饵载体,并检测对报告基因的激活作用。方法：PCR扩增HCV E2661 cDNA片段,先克隆入pMD-18T载体中,经测序正确后,再亚克隆入诱饵载体 pGBKT7,将重组质粒pGBKT7-E2661用醋酸锂法转化入酵母菌AH109,检测目的蛋白在酵母细胞中的表达以及对报告基因有无激活作用。结果：成功构建含有HCVE2661基因片段的酵母双杂交诱饵载体,目的片段可在酵母细胞AH109中正确表达,对酵母菌无毒性且对报告基因无自主激活作用。结论：可利用所构建的pGBKT7-E2661作为酵母双杂交系统中的“诱饵”,进行相互作用分子的筛选研究。     

酵母双杂交筛选心脏cDNA文库中与人热激蛋白70相互作用的蛋白质

目的:利用酵母双杂交系统从人心肌cDNA文库中筛选与热激蛋白70(HSP70)相互作用的蛋白质。方法:从人心脏cDNA文库扩增Hsp70基因,克隆于pGBKT7载体上,酶切鉴定及序列分析,并检测pGBKT7-Hsp70酵母细胞AH109中的自激活活性;将构建的酵母表达诱饵质粒载体pGBKT7-Hsp70转化AH109酵母细胞,与转化有人心脏cDNA文库的酵母Yl87进行交配实验,筛选与HSP70相互作用的蛋白质,通过一对一的回复杂交实验排除假阳性,对阳性克隆进行序列测定和生物信息学分析。结果:构建了"诱饵"质粒栽体pGBKT7-Hsp70,并证明其在酵母双杂交系统中无自激活活性,筛选得到多个与Hsp70相互作用的阳性转化子,并最终得到HSP70的1个相互作用蛋白质HIP。结论:应用酵母双杂交系统筛选出与HSP70相互作用的1个蛋白质,它们的相互作用可能与HSP70发挥细胞分子伴侣作用有关。     

HeLa细胞cDNA文库及酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-CPn0308的构建

旨在利用酵母双杂交系统构建HeLa细胞的cDNA文库,并构建酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-CPn0308。从HeLa细胞中提取总RNA,应用SMARTTM技术,构建以pGADT7-Rec为载体的HeLa细胞酵母GAL4 AD融合cDNA文库。应用PCR技术扩增目的片段CPn0308,并成功克隆该基因到诱饵载体pGBKT7中,将重组质粒转化酵母菌株AH109后,检测诱饵载体有无自激活和细胞毒性作用。结果显示,文库展现良好的多态性,重组诱饵载体pGBKT7-CPn0308不具有毒性且未自主激活报告基因,说明该文库和诱饵质粒可用于酵母双杂交系统。     

用酵母双杂交系统鉴定DNA-PKcs磷酸化簇区域和DNA-PKcs单链抗体anti-DPK3-scFv间的相互作用

目的:构建DNA依赖蛋白激酶催化亚单位(DNA-PKcs)磷酸化簇区域的酵母双杂交诱饵载体及针对该区域的单链抗体anti-DPK3-scFv的猎物蛋白的表达载体,并进行活性和相互作用鉴定。方法:应用PCR方法扩增DNA-PKcs磷酸化簇区域和anti-DPK3-scFv并将它们分别克隆至诱饵载体p GBKT7和猎物载体p GADT7中,经酶切和测序鉴定正确后,用LiAc法转化到酵母菌株AH109中,鉴定诱饵蛋白和猎物蛋白的毒性和自激活活性,并通过酵母双杂交方法验证DNA-PKcs磷酸化簇区域和anti-DPK3-scFv的相互作用。结果:扩增出DNA-PKcs磷酸化簇区域和anti-DPK3-scFv并分别将它们克隆至p GBKT7和p GADT7载体中,转化酵母细胞发现它们对酵母细胞的生长均无毒害作用,自激活活性分析显示诱饵质粒和猎物质粒均无自激活活性,并证实DNA-PKcs磷酸化簇区域能够与anti-DPK3-scFv在体外直接相互作用。结论:构建了DNA-PKcs磷酸化簇的诱饵质粒p GBKT7-DPC,为后续筛选与DNA-PKcs磷酸化簇区域相互作用的蛋白奠定了实验基础。     

人类RhoxF1蛋白的生物信息学分析及其自激活检测

目的：生物信息学分析人类RhoxF1蛋白的氨基酸序列,构建RhoxF1酵母双杂交诱饵载体,并检测其自激活活性。方法：生物信息学分析RhoxF1蛋白保守区域,比较小鼠Rhox5与人RhoxF1的氨基酸序列同源性,PCR扩增RhoxF1基因,与PMD-18-T载体连接,然后把RhoxF1克隆到pGBKT7载体中,醋酸锂法将重组质粒pGBKT7-RhoxF1转入酵母菌AH109,观察pG-BKT7-RhoxF1在AH109中的表达情况,检测诱饵载体有无毒性和自激活作用。结果：RhoxF1蛋白保守区域有大量的DNA结合位点,与Rhox5具有30%的同源性。成功构建诱饵载体pGBKT7-RhoxF1,目的片段可在酵母AH109中表达,并且对酵母菌无毒性,对报告基因无自激活功能。结论：探索了RhoxF1的蛋白特性,成功构建pGBKT7-RhoxF1重组质粒,可以作为酵母双杂交诱饵载体筛选与RhoxF1相互作用的蛋白,进而对其进行功能性研究。     

酵母双杂交筛选类固醇激素合成急性调节蛋白的相互作用蛋白质

目的:利用酵母双杂交技术筛选人肝cDNA文库中与类固醇激素合成急性调节蛋白(STAR)相互作用的蛋白质。方法:将全长STAR基因克隆到酵母表达载体pDBLeu中,形成诱饵;将构建好的诱饵质粒转化至AH109酵母感受态中,利用酵母双杂交技术筛选人肝cDNA文库中与其相互作用的蛋白质,并进行相互作用的回转验证。结果:构建了酵母诱饵蛋白表达质粒pDBLeu-STAR,并筛选到6个猎物,其中有5对相互作用回转验证阳性。结论:为进一步研究STAR的功能和作用机制提供了新的线索。     

TNF-α转化酶酵母双杂交系统"诱饵"质粒的构建及鉴定

目的：构建酵母双杂交系统“诱饵”质粒载体pGBKT7-TACE,并检测其是否具有自身激活及毒性作用。方法：从小鼠肝组织提取总RNA,用RT-PCR的方法获得TACE,克隆于pGBKT7载体上,酶切鉴定及序列分析,并检测pGBKT7-TACE在MATH-MAKER GAL4 Two-Hybrid System 3中的自激活和毒性作用。结果：本实验成功构建了“诱饵”质粒载体pGBKT7-TACE,并证明其在酵母双杂交系统中无自激活及毒性作用。结论：构建的诱饵质粒pGBKT7-TACE可应用在酵母双杂交系统中,为筛选小鼠cDNA文库中与TACE相互作用的蛋白奠定实验基础。     

PRAS40与14-3-3蛋白各亚型相互作用的酵母双杂交系统检测

PRAS40是近几年新发现的Akt作用底物,14-3-3结合蛋白。为确定PRAS40与14-3-3蛋白7种亚基间相互作用关系,利用gateway方法构建用于酵母双杂交系统的诱饵质粒pEG-PRAS40及转录激活质粒pJG-PRAS40,将PRAS40和14-3-3各亚型质粒分别作为诱饵蛋白质粒及转录激活质粒共转化酵母细胞EGY48,通过氨基酸营养缺陷生长实验及β-半乳糖苷酶显色反应分析两种蛋白相互作用程度。酶切鉴定证实成功地构建了pEG-PRAS40和pJG-PRAS40质粒,酵母双杂交实验结果显示PRAS40可以和14-3-3亚型tau,beta,zeta及epsilon相结合,epsilon较强,beta和zeta次之,tau较弱。此结果将为深入研究PRAS40与14-3-3蛋白生物学功能及发现药物靶标奠定基础。     

核转录因子TR3及其缺失突变体在酵母双杂交系统中转录激活作用的检测

目的:检测TR3及其转录活性域缺失突变体在酵母双杂交系统中的转录自激活作用。方法:采用PCR方法扩增TR3全长序列及其缺失突变体,构建酵母双杂交系统的诱饵载体pGBKT7-TR3和pGBKT7-TR3/Δ1～690,将pGBKT7-TR3转化感受态酵母菌AH109后培养于含缺失培养基的平板上,检测β-半乳糖苷酶活性,判定其是否具有转录自激活作用。结果:构建了包含TR3全长序列和TR3/Δ1～690序列的诱饵载体,转化酵母菌AH109后在双缺和三缺培养基上未能使β-半乳糖苷酶活性滤纸片变蓝,说明β-半乳糖苷酶报告基因未被激活。结论:TR3及其转录活性域缺失突变体没有转录自激活作用,可用于酵母双杂交系统。     

组蛋白酵母双杂交诱饵载体的构建及其自激活作用检测

目的:构建组蛋白 H2A、H2B、H3、H4的酵母双杂交诱饵载体,检测其在酵母细胞中的表达和自激活活性,为应用酵母双杂交系统筛选与组蛋白相互作用的蛋白奠定基础.方法:扩增 H2A、H2B、H3、H4蛋白基编码区 cDNA序列,克隆至酵母表达载体 pGBK-T7中,再将其转化至酵母细胞 AH109中,提取酵母总蛋白,检测各种组蛋白的表达,并检测表达的组蛋白在酵母细胞中对报告基有无自激活作用.结果:将 H2A、H2B、H3、H4基的 cDNA 克隆至酵母表达载体 pGBK-T7中,其中组蛋白 H4得到正确表达,且对报告基 LacZ、HIS3、Ade 无激活作用.结论:可以利用酵母双杂交系统筛选与 H4相互作用的蛋白质.     

人FAM92A1基因诱饵表达质粒的构建与鉴定

目的 构建人FAM92A1基因（hFAM92A1）的诱饵表达质粒pGBKT7-hFAM92A1并检测其蛋白表达、毒性和自激活作用.方法 PCR扩增hFAM92A1的基因编码序列并克隆入诱饵表达载体pGBKT7中,酶切和测序鉴定后,转化到酵母AHl09细胞中,Western印迹检测诱饵蛋白表达情况,同时检测诱饵蛋白的毒性和自激活作用.结果 成功构建FAM92A1基因的诱饵表达质粒pGBKT7-hFAM92A1,测序结果正确.Western印迹实验证实酵母细胞高表达诱饵蛋白hFAM92A1,诱饵蛋白没有自激活作用.结论 构建的诱饵表达质粒pGBKT7-hFAM92A1可用于下一步酵母双杂交系统实验,为进一步研究hFAM92A1功能奠定了基础.     

VSV糖蛋白酵母双杂交诱饵载体的构建及其自激活作用的检测

构建水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)酵母双杂交诱饵载体,检测其在酵母细胞中的表达和自激活作用,为进一步研究酵母双杂交系统筛选与VSV-G相互作用蛋白奠定基础。通过RT-PCR方法从水泡性口炎病毒(VSV)克隆糖蛋白(G)基因,BamH I和Sal I双酶切后连接诱饵载体pSos,获得诱饵质粒pSos-VSV-G,经测序鉴定后pSos-VSV-G转化到酵母菌株cdcH25(α),在营养缺陷培养基中观察pSos-VSV-G的自激活作用和毒性作用,同时利用蛋白印迹法分析诱饵蛋白的表达。成功扩增VSV-G基因,并准确克隆入pSos中,诱饵载体pSos-VSV-G成功转化到酵母菌株cdcH25(α)中,经表型筛选检测无自激活作用和毒性作用,蛋白印迹法检测证实pSos-VSV-G在酵母细胞中表达诱饵蛋白。可以利用酵母双杂交系统筛选与VSV-G相互作的蛋白质。     

PML-C与GINS2蛋白相互作用的胞内验证

目的 通过胞内实验验证PML-C与GINS2蛋白之间的相互作用.方法 将诱饵蛋白质粒pGBKT7-PML-C和文库蛋白质粒pACT2-GINS2共转化AH109酵母菌,通过一对一的酵母双杂交技术验证两者在活细胞内的相互作用;构建pCMV-HA-PML-C及pCMV-Myc-GINS2真核表达载体并共转染人胚肾293细胞,利用免疫共沉淀技术验证二者之间的相互作用.结果 pGBKT7-PML-C诱饵蛋白质粒和pACT2-GINS2靶蛋白质粒共转化AH109酵母菌后,可见蓝色阳性克隆生长;pCMV-HA-PML-C及pCMV-Myc-GINS2真核表达载体构建成功,共转染293细胞,抗HA多克隆抗体沉淀与HA-PML-C相互作用的蛋白复合物后,用抗Myc单克隆抗体进行Western印迹检测,可以检测到Myc-GINS2蛋白.结论 利用酵母双杂交和免疫共沉淀技术在胞内验证了PML-C与GINS2间存在相互作用.     

利用酵母双杂交系统从人胚胎肝脏cDNA文库中筛选与JNKK2相互作用的蛋白

目的:利用酵母双杂交系统,以149位赖氨酸突变成甲硫氨酸的c-Jun N端激酶激酶2(JNKK2)失活突变体(JNKK2KM)为诱饵,从人胎肝文库中筛选能与JNKK2作用的蛋白。方法:构建诱饵质粒p GBKT7-JNKK2KM,将其转化到AH109感受态酵母菌中进行扩增,而后检测融合蛋白表达、自激活活性以及对宿主的毒性;将诱饵酵母菌与含有人胎肝c DNA文库质粒的Y187交配进行酵母双杂交筛选,经缺陷型培养基筛选排除假阳性克隆;取阳性菌落抽提质粒进行酶切鉴定,对鉴定后的阳性克隆进行测序及生物信息学分析,明确筛选出的蛋白信息,通过免疫共沉淀实验验证筛选出的蛋白与JNKK2的相互作用。结果:构建了诱饵质粒,检测到融合蛋白的表达,且无自激活作用,未发现对宿主存在毒性;初步筛选到120个阳性克隆,经多轮重复验证得到阳性克隆11个,经生物信息学分析最后确定3个可以与JNKK2相互作用的新蛋白质分子为鸟嘌呤核苷酸结合蛋白β多肽2样蛋白1(GNB2L1)、开放读框60(ORF60)与泛素样修饰物激活酶3(UBA3),免疫共沉淀实验表明它们均能与JNKK2发生相互作用。结论:筛选到3个新的JNKK2相互作用蛋白,为深入探究JNKK2在肝脏中的作用奠定了基础。     

日本脑炎病毒E蛋白在酵母双杂交系统中的表达及其对报告基因激活作用的检测

用日本脑炎病毒(JEV)E蛋白基因片段构建酵母双杂交诱饵载体,并检测其表达产物对酵母细胞有无毒性作用及对报告基因有无激活作用。用RT—PCR从JEV感染的鼠脑中扩增出JEV E蛋白基因片段,克隆入pUCl9质粒,经测序正确后,再亚克隆入酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中。将重组质粒导入酵母菌AHl09,检测其表达产物在酵母细胞中对报告基因有无激活作用。成功获得JEV E蛋白基因片段,表达的E蛋白对酵母菌AHl09无毒性,对报告基因亦无激活作用。为利用酵母双杂交GAL4系统3进行JEV细胞受体蛋白的研究奠定了基础。