HIV-1 p24蛋白在大肠肝菌中的高效可溶性表达、一步纯化及抗原性分析

合成引物扩增HIV-1 p24基因,并将其克隆到pQE-30质粒中,使其在大肠杆菌E.coli M15中以IPTG诱导高效表达,经SDS-PAGE分析,该表达产物约占菌体总蛋白20%,并且以可溶蛋白的形式存在于细菌裂解液上清之中.经镍离子柱亲和层析一步纯化,洗脱产物中p24蛋白纯度达95%.ELISA分析表明,该蛋白可与HIV感染者血清发生特异性免疫反应.以此蛋白交联Sepharose 4B,亲和层析纯化HIV感染者血清中的抗体,用所得抗体与HIV确认试剂反应,发现该纯化抗体仅与确认试剂中的p24蛋白反应.上述结果表明在大肠杆菌中已经高效表达了可溶性HIV-1 p24蛋白,该蛋白具有良好的抗原性.     

HIV—1 P24截短体与gp41截短体的融合蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化和鉴定

用基因重组技术将截短的HIV－1 p24基因和gp41基因连接成嵌合基因,插入质粒pGEX-4T3,构建成重组表达质粒pGEX-F。将pGEX-F转化大肠杆菌BL21。经IPTG诱导表达,pGEX-F在大肠杆菌BL21中获得了高效表达。融合蛋白P24－gp41经Glutathione-Sepharose4B亲和层析纯化后,用间接ELISA和免疫印迹检测HIV抗体阳性血清和正常人血清,P24－gp41只与HIV抗体阳性血清反应,证明获得的融合蛋白P24－gp41有很强的抗原特异性和免疫反应性,具有较高的应用价值。     

猪细小病毒1型VP2基因的原核表达及反应原性分析

旨在研究猪细小病毒1型(PPV1)VP2蛋白(第155-439位氨基酸)的抗原性,为开发PPV1的检测方法奠定基础。以PPV1型AV31株的DNA为模板,扩增获得849 bp的目的片段,扩增产物克隆入p ET30a(+)原核表达载体,构建p ET30aPPV1-VP2(155-439 aa)重组质粒,转入大肠杆菌BL21(DE3);在37℃,以1 mmol/L IPTG诱导表达6 h;采用Ni-NTA树脂亲和层析纯化重组蛋白,并用不同浓度的尿素对纯化蛋白进行复性。SDS-PAGE分析表明,该VP2编码基因在大肠杆菌中得到表达,蛋白大小约为39 k D;Western blot检测结果表明,该重组蛋白与PPV1阳性血清发生特异性反应,与NA-PRRSV和PCV2阳性血清不发生交叉反应。该实验成功构建了PPV1-VP2(155-439 aa)原核表达载体,实现了在大肠杆菌中的表达,纯化后的复性蛋白具有较好的反应原性。     

牛病毒性腹泻病毒E2抗原表位表达及验证

[目的]获得高效表达的重组牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhoea virus,BVDV)E2免疫抗原蛋白。[方法]应用软件分析BVDV-E2蛋白抗原表位,将富含抗原表位基因片段连接表达载体p GEX-4T-1,并转化至大肠杆菌(DE3),经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western Blot检测诱导表达蛋白,经镍柱分离纯化;以纯化蛋白为包被抗原,用间接ELISA检测抗原对免疫血清的反应性。[结果]成功克隆BVDV-E2抗原表位基因,并在大肠杆菌中高效表达,Western Blot和ELISA证实表达重组蛋白对BVDV阳性血清具有反应原性。[结论]获得大小为49.5 k Da的BVDV-E2抗原表位蛋白,并且该抗原稀释度在1:40,抗体稀释度在1:20时结合效果最佳。可用于后续的纳米抗体筛选的研究。     

猴免疫缺陷病毒衣壳蛋白p27在大肠杆菌中的表达及纯化

目的获得用于SIV检测的衣壳蛋白p27重组抗原。方法利用生物信息学软件选择衣壳蛋白p27抗原表位集中的区域,合成SIV p27基因;将该基因与pMAL-p5x载体连接构建pMAL-p5x-p27重组质粒,并转化大肠杆菌BL21中,诱导表达;用Amylose Resin亲和层析柱对表达产物进行纯化。结果 SDS-PAGE分析显示,pMAL-p5x-p27重组质粒可在大肠杆菌中高效表达,表达产物分子量约为70×103;经纯化获得目的蛋白p27纯度可达90%。结论本研究利用原核表达系统成功表达了SIV p27蛋白,为SIV检测方法的建立奠定了基础。     

Epstein-Barr病毒包膜糖蛋白gp85的原核表达

目的:利用大肠杆菌BL21诱导表达GST-gp85融合蛋白,进行动物免疫制备多克隆抗体。方法:通过PCR反应从EB病毒转染的绒猴淋巴细胞系B95-8细胞中获得了gp85BXLF2基因,将此基因克隆到大肠杆菌表达载体pGEX-5T,得到阳性克隆pGEX5T-85。转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达重组蛋白,表达产物经SDS-PAGE分析、尿素变性、复性和亲和层析纯化,并用初步纯化的蛋白免疫BALB/c小鼠。结果:SDS-PAGE可见在相对分子质量约100000处有蛋白条带,Western印迹表明该蛋白可与免疫的BALB/c小鼠血清及鼻咽癌血清起特异性反应。结论:在大肠杆菌细胞中成功表达了GST-gp85融合蛋白,该蛋白具有较好的抗原性和免疫原性。     

SARS病毒N蛋白、E蛋白在大肠杆菌中的表达与鉴定

本研究通过RT-PCR反应获得了SARS冠状病毒核衣壳蛋白(N)和膜蛋白(E)基因,将n基因和e基因克隆到大肠杆菌表达载体pGEX KG上,并在大肠杆菌中以可溶形式获得高效表达,表达产物经亲和层析纯化.重组蛋白N与SARS病毒抗体呈现特异性的反应,为进一步研究SARS病毒感染免疫应答机制和早期诊断奠定基础     

新型rhNDPK-A工程菌的构建及表达产物纯化研究

目的 :为简化纯化过程 ,获得有临床研究价值的rhNDPK -A蛋白 ,构建新型rhNDPK -A基因的表达质粒 ,利用 6×His标签以Ni+ -NTA亲和层析柱纯化蛋白。方法 :将抑癌基因nm2 3-H1从质粒PBVNMH1中亚克隆于带有纯化标签的表达载体pQE4 0中。IPTG诱导表达目的蛋白。通过镍离子螯合层析柱一步纯化法纯化目的蛋白。结果 :pQE - 4 0中亚克隆的nm2 3-H1序列完全正确 ;目的蛋白在大肠杆菌M15中的表达量可达 4 9.6 % ;Ni+ -NTA亲和层析柱一步纯化后蛋白纯度为 93%。结论 :构建了带有 6×His纯化标签的新型rhNDPK -A基因表达质粒pQE -nm2 3H1,所构建质粒能高效表达目的蛋白 ,利用Ni+ -NTA亲和层析柱简便高效地纯化了表达产物。     

肠道病毒71型外壳蛋白VP1全长在大肠杆菌中的高效表达及初步活性测定

目的:重组表达肠道病毒71型(EV71)外壳蛋白VP1全长,用于研制血清学检测试剂和疫苗研发。方法:在获得EV71全长基因并测序正确的基础上,将外壳蛋白VP1全长基因克隆到表达载体pET28a(+)上,构建重组表达质粒pET28a(+)/VP1,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,利用Ni2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,采用双抗原夹心检测技术评价重组抗原与27份EV71抗体阳性血清和18份阴性血清的反应情况。结果:重组EV71-VP1蛋白在大肠杆菌中诱导6 h后可获得高效表达,能与27份EV71抗体阳性血清中的21份发生阳性反应,EV71双抗原夹心检测与中和血清测试结果具有很好的一致性(P0.05)。结论:实现了肠道病毒71型外壳蛋白VP1的高效表达,为肠道病毒71型诊断试剂和疫苗的研究奠定了基础。     

HER-2/neu胞外配体结合区2在大肠杆菌中可溶性表达及纯化

用PCR技术扩增HER 2 neu胞外配体结合区 2 (RLD2 )cDNA ,并将扩增的基因片段克隆于硫氧还蛋白 (TrxA)原核表达载体中 ,获得TrxA RLD2融合蛋白的可溶性表达 .通过插入偶联翻译序列 ,实现TrxA与RLD2蛋白在大肠杆菌中的共表达 .表达产物经免疫印记检测可被抗HER 2 neu特异性抗体识别 .经离子交换层析和钴亲和层析纯化 ,RLD2蛋白的纯度达 90 % .用质谱法分析RLD2蛋白的分子量 ,与预期值相符 .结果表明 ,利用TrxA表达体系在大肠杆菌中获得了HER 2 neuRLD2蛋白高效可溶性表达     

HIV-1型核衣壳蛋白P24截短体在大肠杆菌中的表达,纯化和鉴定

用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）从ＨＩＶ １ｇａｇ基因中扩增出衣壳蛋白Ｐ２４截短体（ｔＰ２４）基因,插入质粒ｐＧＥＸ ４Ｔ３中构成重组表达质粒ｐＧＥＸ ｔｐ２４,将ｐＧＥＸ ｔｐ２４转化大肠杆菌ＢＬ２１后获得了高效表达,表达量占菌体总蛋白量的３４３８％。经Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和层析纯化的截短体Ｐ２４纯度为９２７７％。纯化的截短体Ｐ２４在间接ＥＬＩＳＡ和免疫印迹检测ＨＩＶ抗体阳性血清和正常人血清中,具有很高的抗原特异性和免疫反应性。     

Expression of bovine leukemia virus protein p24 in Escherichia coli and its use in the immunoblotting assay.

The gag gene encoded protein, p24 of bovine leukemia virus (BLV), was cloned and expressed as thioredoxin-6xHis-p24 protein in Escherichia coli. The bacterial cells carrying plasmid pT7THis-p24 expressed the protein of 38 kDa that was detected by immunoblotting analysis using anti-p24 monoclonal antibodies and sera from BLV infected cattle and sheep. The purified p24 fusion protein was shown to be sensitive and specific for detection of BLV antibodies in the infected cattle.     

HIV-1 Gag p17-p24在痘苗病毒中的表达及性质研究

研究了重组痘苗病毒表达的HIV1核心蛋白(Gag)p17p24蛋白的一些生物学及免疫学特点。间接免疫荧光、DotELISA及Westernblot结果表明,构建的两株重组病毒分别表达了HIV1Gagp24及p17p24融合蛋白。电镜观察证实,Gagp24及p1724重组蛋白均可形成病毒样粒子。重组病毒可诱导小鼠产生抗HIV1Gagp24抗体。重组病毒感染BHK21细胞后,可见由于细胞凋亡而致的染色体DNA断裂“梯子”电泳图。     

Ad5-knob蛋白在大肠杆菌中可溶性表达及其活性检测

采用PCR技术, 从AdEasy 1质粒DNA中获得knob全长序列, 克隆入pGEM T vector中。DNA测序鉴定后, 构建pQE 30/knob重组表达载体, 转化大肠杆菌M15 pREP4),IPTG诱导表达腺病毒5 型纤维蛋白的knob功能域(Ad5 knob), SDS PAGE分析,表达产物主要以可溶性蛋白的形式存在于细菌裂解液上清之中。经Ni2 NTA亲和层析一步分离纯化后,洗脱产物中Ad5 knob蛋白纯度超过95%。N 端氨基酸测序证实了纯化产物为Ad5 knob蛋白,细胞受体结合实验检测到所得蛋白能够与Hela细胞上的相应受体特异性结合。上述结果表明在大肠杆菌中已经高效表达了可溶性Ad5 knob蛋白,一步即纯化该蛋白,并具有良好的生物活性,为其下阶段的深入研究提供了重要的实验材料。     

幽门螺杆菌VacA重组蛋白表达、纯化及鉴定

目的研究幽门螺杆菌空泡毒素（VacA）编码基因在大肠埃希菌中的表达及纯化重组蛋白的抗原性。方法将PET32a-vacA-E.coli BE21（DE3）工程菌株常规培养,碱裂解法小量提取重组质粒DNA,琼脂糖凝胶电泳进行酶切鉴定,基因测序法进行插入基因序列分析。重组蛋白采用IPTG诱导表达,镍亲和层析原理提纯,ELISA法检测其抗原性。结果经酶切鉴定表明,插入的基因片段全长约2240bp,测序分析及与Genebank比较,可以肯定插入片段为vacA基因,ELISA法检测重组蛋白具有良好的抗原性。结论VacA重组蛋白在大肠埃希菌中成功表达,重组蛋白具有良好的抗原性。     

HIV P66蛋白的表达、纯化及活性检测

此研究的目的是体外表达HIV-1逆转录酶P66亚单位蛋白,并得到纯度较高且具有活性的重组蛋白。首先通过PCR方法从含HIV-1 HXB2标准株全基因的质粒中扩增出全长p66基因,插入表达载体pTWIN1,构建pTWIN-p66质粒。再将该质粒转化到表达菌BL21,在IPTG诱导下表达P66蛋白。表达产物经几丁质柱一步纯化后得到P66蛋白纯品。纯化的P66蛋白分别催化B95-8细胞总RNA、RT试剂盒中对照RNA进行逆转录;同时以试剂盒中的M-MLV RT为对照进行相同的逆转录,PCR后电泳比较活性。结果显示我们构建的pTWIN-p66质粒在IPTG诱导下在原核细胞中P66亚单位蛋白表达量较高,经一步纯化后蛋白凝胶扫描纯度达88%,并具有较好的逆转录活性。与M-MLV RT体外活性比较,两者活性相当。该研究为进一步开发国产HIV确证诊断试剂及抗AIDS药物的研究打下了初步基础。     

Comparison of recombinant human immunodeficiency virus gag precursor and gag/env fusion proteins and a synthetic env peptide as diagnostic reagents

Diagnostic reagents for detection of human immunodeficiency virus (HIV) exposure with improved reliability may be provided by viral encoded proteins produced by recombinant DNA techniques or by synthetic peptides corresponding to appropriate viral epitopes. We have expressed at high levels in E. coli a gag gene segment corresponding to approximately 97% of the p55 gag precursor protein, as well as a novel gag/env fusion protein that contains antigenic determinants in common with gag p24, env gp41, and env gp120. The gag and gag/env proteins were purified from insoluble inclusion bodies by sequential extraction with increasing concentrations of urea. These components were tested for reactivity with antisera to HIV proteins and peptides. We have also chemically synthesized a peptide corresponding to env residues 578-608, representing a portion of env gp41. The final preparation of gag and gag/env proteins in 8 M urea reacted with sheep anti-HTLV-III p24 gag antibodies and acquired immune deficiency syndrome (AIDS) patient sera. The gag/env fusion protein also reacted with rabbit anti-HIV env 500-511 peptide antibody. Both recombinant proteins and the env peptide were suitable as reagents for evaluation of serum samples by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Results of ELISA assays utilizing the recombinant viral proteins and synthetic peptide were in good agreement with results obtained using disrupted virus as antigen in ELISA assays and immunoblotting.     

结核分枝杆菌ESAT-6蛋白的重组表达及膜定位研究

从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出ESAT-6基因,克隆入pET21a(+)载体.将成功构建的pET21a(+)-ESAT-6重组质粒转化入感受态BL21(DE3)中,经诱导表达后,使用SDS.PAGE和Western blot鉴定.超声破碎后发现目的蛋白以可溶性表达形式存在,经过Ni-NTA柱和DEAE-Seph...     

巴尔通体（Bartonella tribocorum）P26蛋白原核重组表达研究

目的 构建巴尔通体表面蛋白p26基因的原核重组表达载体,表达和纯化重组表达蛋白P26,并鉴定其抗原性.方法 利用PCR方法从巴尔通体B.tribocorum厦门分离株的基因组DNA中扩增出p26蛋白基因,并将该基因的编码区克隆到pGEX-4T-1表达载体中,从而构建GST-p26融合蛋白原核重组表达载体.将表达载体转化大肠埃希菌（E.coli DH5α）,诱导表达GST-p26,并运用亲和层析技术纯化蛋白.通过蛋白质斑点印迹试验和间接ELISA法检验GST-p26是否具有抗原性.结果 成功构建了p26的原核表达载体,该表达载体可在E.coli DH5α中大量表达GST-p26,原核表达的GST-p26能够与感染动物血液样本发生特异性免疫反应.结论 原核重组表达的GST-p26可作为潜在的抗原,应用于巴尔通体的血清学检测.