Epstein-Barr病毒包膜糖蛋白gp85的原核表达

目的:利用大肠杆菌BL21诱导表达GST-gp85融合蛋白,进行动物免疫制备多克隆抗体。方法:通过PCR反应从EB病毒转染的绒猴淋巴细胞系B95-8细胞中获得了gp85BXLF2基因,将此基因克隆到大肠杆菌表达载体pGEX-5T,得到阳性克隆pGEX5T-85。转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达重组蛋白,表达产物经SDS-PAGE分析、尿素变性、复性和亲和层析纯化,并用初步纯化的蛋白免疫BALB/c小鼠。结果:SDS-PAGE可见在相对分子质量约100000处有蛋白条带,Western印迹表明该蛋白可与免疫的BALB/c小鼠血清及鼻咽癌血清起特异性反应。结论:在大肠杆菌细胞中成功表达了GST-gp85融合蛋白,该蛋白具有较好的抗原性和免疫原性。     

体外定点突变法构建凝血因子Ⅶ C329G突变型真核表达载体

以野生型凝血因子Ⅶ（FⅦ）真核表达载体为模板,通过定点突变方法构建FⅦC329G突变型表达载体;序列分析鉴定C329G突变重组子。重组子目的基因的序列分析结果显示FⅦ基因编码的第329个半胱氨酸残基被甘氨酸残基替换（C329G）,即成功构建了FⅦC329G突变型真核表达载体,为下一步在哺乳类细胞中表达该突变型FⅦ,并对其进行功能性研究提供了条件。     

丙型肝炎病毒抗体化学发光免疫检测方法的建立及其临床应用简

目的：建立丙型肝炎病毒（rmv）抗体化学发光免疫检测方法,并分析其临床应用价值。方法：应用基因工程重组的HCV抗原包被微孔板,以辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG为二抗,并结合鲁米诺化学发光底物系统,建立HCV抗体化学发光免疫检测方法;应用HCV抗体诊断试剂国家参考品分析所建立方法的特异性、灵敏度、稳定性和精密性,并-9北京万泰公司的ELISA试剂盒同时检测临床血清样本350份,比较检测结果。结果：检测结果符合国家参考品质量标准。批内变异系数5．1％。6．6％,批间变异系数9-5％;试剂盒置37℃考核3d,其稳定性良好;与万泰公司的ELISA检测结果对照,阳性符合率分别为99．0％,阴性符合率分别为100％,总符合率为99．4％;Kappa值为0．986,一致性强度最强。结论：建立了特异、敏感和稳定的HCV抗体化学发光免疫检测方法,适用于HCV感染的批量筛查,具有较大的临床应用价值。     

EB病毒包膜糖蛋白gp85真核表达载体的构建

用基因工程技术克隆EB病毒中抗原性较强的膜蛋白gp85的编码基因BXLF2,构建真核表达载体。以EB病毒B95—8细胞培养上清为模板,PCR扩增出BXLF2基因。PCR产物经SnaBⅠ和NotⅠ双酶切后克隆至毕赤酵母表达载体pPIC9K,用双酶切和DNA测序鉴定重组质粒。重组质粒双酶切的片段大小与预期符合,重组克隆外源基因的测序结果与献报道一致。结果表明,EB病毒gp85的编码基因BXLF2被成功地克隆入真核表达载体pPIC9K,为下一步在毕赤酵母中表达EB病毒gp85蛋白建立了基础。     

ING1抑癌基因

采用ｃＤＮＡ消减杂交和体内选择技术,Ｇａｒｋａｒｔｓｅｖ等分离了一个新的肿瘤抑制基因－ＩＮＧ１。该基因定位于人类染色体１３ｐ３３－３４,其ｃＤＮＡ长约２ｋｂ;编码了一种分子量为３３ｋＤ的核蛋白－ｐ３３＾ＩＮＧ１。研究发现,ｐ３３＾ＩＮＧ１的过表达可有效抑制细胞生长,促进无生长因子条件下的细胞凋亡。     

肿瘤干细胞标记分子CD133在胶质瘤细胞U87中的稳定表达

目的：在体外胶质瘤U87细胞中稳定表达肿瘤干细胞标记分子CD133。方法：通过脂质体介导将表达载体质粒CD133-1／pCR3．1-Uni转染U87细胞,G418筛选稳定表达抗性的细胞株;用细胞免疫荧光染色鉴定表达CD133分子的U87细胞。结果：转染CD133表达载体的U87细胞可以被CD133单抗识别,而转染空载体的U87细胞免疫染色结果为阴性,表明CD133分子在U87细胞中稳定表达。结论：U87细胞稳定表达CD133分子,为体内外分析CD133阳性U87细胞特性奠定了基础：U87CD133阳性细胞可以作为免疫组化或流式细胞术等检测其他肿瘤干细胞CD133表达的阳性对照细胞。     

NADH-细胞色素b5还原酶在大肠杆菌中的表达及其产物的纯化

为了探讨 NADH-细胞色素 b5还原酶基因突变引起遗传性高铁血红蛋白血症的分子病理机制 ,研究突变型 ( b5R)蛋白结构和功能的关系 ,用基因重组技术将野生型和突变型 ( C2 0 3Y) b5Rc DNA克隆于 p GEX- 2 T载体 ,在大肠杆菌 BL2 1中诱导表达 .Western印迹鉴定所表达的蛋白为GST- b5R融合蛋白 .应用谷胱甘肽 - Sepharose 4B亲和层析 ,还原型谷胱甘肽洗脱得到纯化的GST- b5R和 GST- b5RC2 0 3Y融合蛋白 .比较 GST- b5R和 GST- b5RC2 0 3Y酶活性及稳定性 ,发现野生型和突变型的酶活性基本相同 .但与野生型酶相比 ,突变型酶对热的稳定性较差 ,对胰蛋白酶更加敏感 .结果提示 ,C2 0 3Y突变可引起蛋白质二级结构改变而导致酶的稳定性下降 .     

膜上斑点洁显示人红细胞b_5还原酶活性

人红细胞ＮＡＤＨ－细胞色素ｂ５还原酶是使高铁血红蛋白还原的主要酶类,其缺陷将导致遗传性高铁血红蛋白血症．目前,主要通过分光光度法测定ｂ５还原酶活性．我们将ｂ５还原酶抗体点于硝酸纤维膜上,以此捕获并富集红细胞胞浆ｂ５还原酶．有ｂ５还原酶活性的斑点用噻唑蓝染色．此法简单直观,可用于ｂ５还原酶的定性和半定量测定,为遗传性高铁血红蛋白血症的诊断提供了一种新的实验手段．     

膜上斑点洁显示人红细胞b5还原酶活性

人红细胞NADH-细胞色素b₅还原酶是使高铁血红蛋白还原的主要酶类, 其缺陷将导致遗传性高铁血红蛋白血症. 目前, 主要通过分光光度法测定b₅还原酶活性. 我们将b₅还原酶抗体点于硝酸纤维膜上, 以此捕获并富集红细胞胞浆b₅还原酶. 有b₅还原酶活性的斑点用噻唑蓝染色. 此法简单直观, 可用于b₅还原酶的定性和半定量测定, 为遗传性高铁血红蛋白血症的诊断提供了一种新的实验手段.