Epstein-Barr病毒包膜糖蛋白gp85的原核表达

目的:利用大肠杆菌BL21诱导表达GST-gp85融合蛋白,进行动物免疫制备多克隆抗体。方法:通过PCR反应从EB病毒转染的绒猴淋巴细胞系B95-8细胞中获得了gp85BXLF2基因,将此基因克隆到大肠杆菌表达载体pGEX-5T,得到阳性克隆pGEX5T-85。转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达重组蛋白,表达产物经SDS-PAGE分析、尿素变性、复性和亲和层析纯化,并用初步纯化的蛋白免疫BALB/c小鼠。结果:SDS-PAGE可见在相对分子质量约100000处有蛋白条带,Western印迹表明该蛋白可与免疫的BALB/c小鼠血清及鼻咽癌血清起特异性反应。结论:在大肠杆菌细胞中成功表达了GST-gp85融合蛋白,该蛋白具有较好的抗原性和免疫原性。     

体外定点突变法构建凝血因子Ⅶ C329G突变型真核表达载体

以野生型凝血因子Ⅶ（FⅦ）真核表达载体为模板,通过定点突变方法构建FⅦC329G突变型表达载体;序列分析鉴定C329G突变重组子。重组子目的基因的序列分析结果显示FⅦ基因编码的第329个半胱氨酸残基被甘氨酸残基替换（C329G）,即成功构建了FⅦC329G突变型真核表达载体,为下一步在哺乳类细胞中表达该突变型FⅦ,并对其进行功能性研究提供了条件。     

EB病毒包膜糖蛋白gp85真核表达载体的构建

用基因工程技术克隆EB病毒中抗原性较强的膜蛋白gp85的编码基因BXLF2,构建真核表达载体。以EB病毒B95—8细胞培养上清为模板,PCR扩增出BXLF2基因。PCR产物经SnaBⅠ和NotⅠ双酶切后克隆至毕赤酵母表达载体pPIC9K,用双酶切和DNA测序鉴定重组质粒。重组质粒双酶切的片段大小与预期符合,重组克隆外源基因的测序结果与献报道一致。结果表明,EB病毒gp85的编码基因BXLF2被成功地克隆入真核表达载体pPIC9K,为下一步在毕赤酵母中表达EB病毒gp85蛋白建立了基础。     

甲状腺转录因子-1融合表达载体的构建及体外活性鉴定

目的:构建人甲状腺转录因子-1(TTF1)编码基因的真核表达载体pcDNA3.1/myc-His(-)C-TTF1,并观察其蛋白质体外转录翻译情况。方法:据已知的TTF1基因序列,应用巢式PCR技术,从人肺腺癌细胞株SPC-A1中扩增出TTF1基因,通过TA连接将其克隆入pGEM-T-easy载体,经测序鉴定后,双酶切插入真核表达质粒pcDNA3.1/myc-His(-)C中;重组质粒经XhoⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定后,进行蛋白质体外翻译观察TTF1体外表达情况,用电泳迁移率变动分析(EMSA)验证获得的体外翻译蛋白TTF1是否具有与下游靶基因UGRP1启动子结合的能力。结果:成功构建了含TTF1编码基因的真核表达载体pcDNA3.1/myc-His(-)C-TTF1,并能在体外表达TTF1蛋白。结论:能方便地获得TTF1体外翻译蛋白,为进一步研究TTF1蛋白与相应的DNA反应元件及其他转录因子的相互作用奠定了基础。