玉米蛋白质二硫键异构酶（PDI）基因的特征和表达

蛋白质二硫键异构酶（PDI）对蛋白的折叠和二硫键的形成起重要的作用.此外,PDI还执行许多其他的生物功能,是1个多功能酶. 本文通过研究玉米中1个PDI基因的特征和表达,探讨它的功能作用. 玉米中的PDI基因编码513个氨基酸.同源分析表明,该基因和水稻、小麦的PDI基因聚为一类,有很高的蛋白相似性.蛋白结构分析表明,该基因具有明显的PDI基因的结构特点,包括硫氧还蛋白活性位点(CGHC)以及内质网定位信号(KDEL).Northern杂交分析显示,该基因在发育种子的表达量高,同时受干旱、冷、ABA和盐等逆境胁迫诱导表达.PDI与GFP融合表达研究基因的亚细胞定位,表明该基因定位在除细胞膜外的细胞质和细胞器上.     

蛋白质二硫键异构酶家族的结构与功能

蛋白质二硫键异构酶（protein disulfide isomerase,PDI）家族是一类在内质网中起作用的巯基-二硫键氧化还原酶.它们通常含有CXXC（Cys-Xaa-Xaa-Cys,CXXC）活性位点,活性位点的两个半胱氨酸残基可催化底物二硫键的形成、异构及还原.所有PDI家族成员包含至少一个约100个氨基酸残基的硫氧还蛋白同源结构域.PDI家族的主要职能是催化内质网中新生肽链的氧化折叠,另外在内质网相关的蛋白质降解途径（ERAD）、蛋白质转运、钙稳态、抗原提呈及病毒入侵等方面也起重要作用.     

二硫键异构酶

天然二硫键的形成是许多蛋白正确折叠中的限速步骤,在稳定蛋白质构象和保持蛋白质活性方面起重要作用。讨论的二硫键异构酶是内质网中一种重要的蛋白折叠催化剂,它催化蛋白二硫键的形成和错误配对二硫键的重排,并有抑制错误折叠蛋白聚集的分子伴侣活性。PDI广泛应用于基因工程上提高外源蛋白表达水平。     

几种南海芋螺二硫键异构酶的克隆及进化分析

目的:从来自中国南海的4种芋螺中克隆出包含完整3’和5’非翻译区的蛋白质二硫键异构酶(PDI)全基因序列,并对其进行序列及进化分析。方法:根据各种生物PDI基因的保守区域设计引物,利用3’和5’cDNA末端快速扩增(RACE)方法克隆出PDI全基因序列,并通过生物信息学方法对各芋螺PDI序列进行分析。结果与结论:从中国南海玉女芋螺、黑星芋螺、堂皇芋螺、桶形芋螺cDNA中克隆出包含有完整3’和5’非翻译区的PDI全基因序列;分析结果表明各芋螺之间的同源性大于90%,而与对虾、人类、酿酒酵母的同源性均小于60%;各芋螺PDI与其他生物的2个活性位点序列高度保守,而底物结合位点具有物种特异性,进化树显示各芋螺PDI的特征可能受其捕食食性影响。     

三碘甲腺原氨酸不能与蛋白质二硫键异构酶特异结合

 <正> 蛋白质二硫键异构酶(PDI)是由两个相同亚基组成的蛋白质,分子量约107000,能够催化蛋白质天然二硫键的形成。Edman等在1985年已阐明了鼠PDI的一级结构,近二、三年,又相继报道了三种蛋白的一级结构,它们是脯氨酰-4-羟化酶的β亚基、三碘甲腺原氨酸(T_3)结合蛋白(T_3BP)和蛋白质糖基化部位结合蛋白(GSBP),在氨基酸水平上与PDl分     

大肠杆菌二硫键形成蛋白A（DsbA）研究进展

二硫键形成蛋白A(DisulfidebondformationproteinA,DsbA)是存在于大肠杆菌周质胞腔内的一种参与新生蛋白质折叠过程中催化二硫键形成的折叠酶。综述了DsbA三维结构、进化过程、协助蛋白质体内外复性方面的研究进展。DsbA比硫氧还原蛋白具有更强的氧化性,其强氧化性来自于Cys30残基异常低的pKa值和不稳定的氧化型结构,通过定点突变的研究表明了Cys30残基是DsbA活性中心最关键的氨基酸残基之一。DsbA不论在体内与目标蛋白融合表达还是在体外以折叠酶形式添加,都能有效地催化蛋白质的折叠复性,同时DsbA还具有部分分子伴侣的活性。     

蛋白质二硫键异构酶的结构及抑制剂研究进展

蛋白质二硫键异构酶(PDI)可催化二硫键的形成、断裂和重排,并促进蛋白质折叠,对稳定蛋白质的三维结构至关重要. PDI的表达或酶活性的失调与一系列疾病如癌症、神经退行性疾病、血栓形成等密切相关.本文综述了PDI结构、与疾病的关系及其抑制剂的研究进展,并指出目前PDI抑制剂存在的问题及未来发展方向,以期为PDI抑制剂的进一步研究提供参考.     

羊BLG基因5′和3′调控区克隆及其调控GFP基因在乳腺细胞的表达

乳球蛋白 (ＢＬＧ)是反刍家畜的一种主要乳清蛋白质。将外源基因置于ＢＬＧ 5′调控区下游 ,能够控制外源基因在动物乳腺的组织特异性表达。现已清楚在ＢＬＧ 5′端有多个乳核因子 1(ＮＦ1)和转录因子Ｓｔａｔ5的识别位点 ,此外还存在多个激素作用位点[1 ] 。具有这些调控成分的ＢＬＧ 5′翼端 (5′ｆｌａｎｋｉｎｇ)能够控制外源基因在乳腺的表达 ,但受整合位点、外源基因结构以及转基因拷贝数及其排列方式的影响[2 ] 。研究结果表明 ,仅含有 5′调控区的乳腺表达构件 ,还不能使外源基因的表达达到内源性ＢＬＧ的表达水平 ,因为在 5′远端(…     

棉花生长素应答因子克隆和序列分析

通过电子克隆和RACE相结合的方法,从陆地棉中克隆到一个新ARF基因。序列分析表明,该基因序列全长为2393其中包括87bp的5′非编码区(5′UTR),1941bp的蛋白质编码区,终止密码子TAA和362bp的3′非编码区。该基因可编码647个氨基酸的蛋白质,分子量为71.9kD,等电点(PI)为8.2。该基因含有一个与拟南芥中ARF基因相似的B3结构域和一个Auxin_resp结合位点,表明该基因与拟南芥ARF基因有很高的同源性,推测具有相似或相同的功能。     

PLOD3基因3′调控区的人类特异突变改变miR-124a对PLOD3的调控

microRNAs(miRNAs)是一类在转录后水平调控基因表达的不编码蛋白质的小RNA(长度20—24个碱基)。其中,miR-124a是一个在哺乳动物中枢神经系统高度表达的miRNA,在神经前体细胞向神经元分化的过程中起着举足轻重的作用。由于miRNAs特异性地识别靶基因的3′端调控区(3′UTR)的靶序列,因此,在人类起源过程中基因3′UTR的单核苷酸序列变异有可能导致miRNA调控的改变。通过靶基因预测和3′UTR区在哺乳动物代表物种间的同源序列比较,我们发现miR-124a的靶基因中有一个基因(PLOD3)3′UTR的靶位点中存在人类特异突变位点。利用体外报告基因系统,发现PLOD3基因3′UTR靶位点中所含的一个人类特异的突变导致miR-124a对PLOD3的调控效率降低。研究表明,miRNAs靶基因3′UTR的序列变异具有功能效应,它有可能是人类中枢神经系统在起源和演化中发挥关键作用的重要遗传机制之一。     

共表达分子伴侣PDI和Ero1对葡萄糖氧化酶在毕赤酵母中表达的影响

通过单独表达蛋白质分子伴侣二硫键异构酶(PDI)和共表达PDI和内质网氧化还原酶(Ero1),提高重组葡萄糖氧化酶在毕赤酵母中的分泌表达。将构建的蛋白质分子伴侣表达载体p PICZ/PDI和p PICZ/Ero1-PDI线性化后,电击转化重组毕赤酵母X33/p MD-GOD细胞,用含有250μg/m L G418和50μg/m L Zeocin的YPD双抗平板筛选阳性转化子,阳性转化子进行试管发酵和10 L发酵培养后,分析共表达PDI和Ero1-PDI对GOD表达水平的影响。结果显示,共表达PDI及Ero1-PDI分别使葡萄糖氧化酶在10 L发酵罐中30℃培养,酶活分别达到476 U/m L和736 U/m L,相比原始菌株在相同条件下分别提高了29.7%和100%。整合分子伴侣PDI和Ero1促进蛋白正确折叠明显地提高葡萄糖氧化酶蛋白表达。     

大肠杆菌二硫键形成蛋白A（DsbA）研究进展

二硫键形成蛋白A（Disulfide bond formation protein A,DsbA）是存在于大肠杆菌周质胞腔内的一种参与新生蛋白质折叠过程中催化二硫键形成的折叠酶。综述了DsbA三维结构、进化过程、协助蛋白质体内外复性方面的研究进展。DsbA比硫氧还原蛋白具有更强的氧化性,其强氧化性来自于Cys³⁰残基异常低的pKa值和不稳定的氧化型结构,通过定点突变的研究表明了Cys³⁰残基是DsbA活性中心最关键的氨基酸残基之一。DsbA不论在体内与目标蛋白融合表达还是在体外以折叠酶形式添加,都能有效地催化蛋白质的折叠复性,同时DsbA还具有部分分子伴侣的活性。     

人白介素-4与大肠杆菌二硫键异构酶DsbC在大肠杆菌中的融合表达及羟胺切割后共复性

目的:通过融合表达、羟胺切割、与二硫键异构酶共复性,获得高表达、高纯度、高生物活性的重组人白细胞介素-4(rhIL-4)。方法:将5端引入了羟胺切割位点的hIL-4基因克隆到大肠杆菌二硫键异构酶DsbC的原核表达载体pET-DsbC中,IPTG诱导表达,对包涵体进行纯化,然后在变性条件下经羟胺切割,利用DsbC的分子伴侣功能与hIL-4进行共复性,最后利用阳离子交换层析纯化获得rhIL-4蛋白。结果:融合蛋白DsbC-hIL-4的表达量占细菌总蛋白的40%以上,以包涵体形式存在;纯化后得到的rhIL-4的相对分子量为15×103,与预期一致,电泳纯度达95%;细胞学实验测定其具有良好的生物学活性。结论:通过融合表达的方法可以提高hIL-4的原核表达量;利用共复性的方式极大地提高了hIL-4的复性率和生物活性。     

重组蛋白瑞替普酶的分子生物学及复性研究

重组蛋白瑞替普酶是重组人组织纤溶酶原激活剂(tPA)的缺失变异体(reteplase),为第三代治疗血栓性疾病的溶栓药物,具有半衰期长、出血副作用小的特点,是有前途的新型溶栓药物。在研究开发和产业化过程中的难点是含有9对二硫键,难以提高复性率,综述了瑞替普酶的分子生物学及变性和复性研究进展。     

Split Inteins介导的多肽链两端标记

多肽链多位点特异性标记有助于了解蛋白质的结构与功能,特别是在蛋白质的动态构象研究方面. 但是,现有的多肽链多位点特异性标记方法各有局限性,并且种类有限,所以有必要开发新的多肽链多位点特异性标记方法以满足研究需求. 本文以Diub (ubiquitin dimer) 蛋白为研究对象,借助S1和S11型2种不同的断裂蛋白质内含子 (split inteins) 的蛋白质反式剪接,将含有不同荧光基团的两种小肽成功剪接至靶蛋白的两端,最终达到对靶蛋白的末端标记目的.     

SARS冠状病毒Mc区原核表达及包涵体复性的研究

构建SARS冠状病毒M蛋白膜内区(Mc蛋白)基因(Mc区)融合表达载体,表达并复性该蛋白。克隆Mc区,构建融合表达载体pET-32a(+)/Mc,融合表达Mc蛋白。纯化表达蛋白,采用逐步透析、降低蛋白浓度、加入氧化还原剂复性融合蛋白。用复性蛋白免疫兔产生抗血清,复性蛋白与SARS患者血清和健康人血清反应鉴定复性结果。结果显示,复性蛋白免疫家兔后产生抗血清,该复性蛋白与SARS患者血清特异结合,表明已成功复性该表达蛋白。为SARS疫苗和诊断试剂的研制奠定基础。     

百脉根NIN旁系同源蛋白的结构歧异和功能分化

目的:研究百脉根(Lotus japonicus)NIN转录因子和它的旁系同源蛋白的结构歧异和功能分化。方法:从百脉根基因组中获取完全的NIN旁系同源蛋白质序列,通过生物信息学手段进行系统发育、理化性质、功能位点和蛋白质三级结构同源建模分析。结果:总共获得5个NIN旁系同源蛋白序列,其中2个属于新鉴别的成员,它们分属于两个不同的进化分支;脯氨酸含量在LjNLP3中比次高的LjNLP1增加33%,提示其具有耐旱的功能特征;功能位点分析显示NIN旁系同源蛋白之间存在差异,提示它们可能通过翻译后修饰发生了功能分化;LjNIN蛋白在进化过程中用一段α螺旋替代了LjNLP1的一段β折叠,这一差异可能导致百脉根Nin招募为根瘤感受基因。结论:初步揭示了百脉根NIN旁系同源蛋白的结构歧异与功能分化的关系,为进一步的实验研究奠定了基础。     

重组抗血红素ScFv包涵体蛋白的复性及纯化研究

抗血红素多二硫键ScFv在大肠杆菌中绝大多数表达产物为包涵体,为了获得可溶性的具有生物活性的ScFv,摸索了不同的复性条件,包括透析法、稀释和层析相结合的方法。研究发现,先对溶解的变性ScFv溶液稀释,进行初步的蛋白质复性,再利用Sephadex G-25凝胶层析进一步复性、降低变性剂浓度和纯化,至少可以得到95％纯度,产率为150mg／L的目标蛋白,通过一次凝胶过滤层析,达到了去除变性剂、复性及纯化ScFv蛋白三种目的,为多二硫键ScFv在大肠杆菌中的表达和纯化提供了一种经济可行的方法。     

人源抗狂犬病毒单链二硫键稳定抗体的重组设计与表达

以人源抗狂犬病毒糖蛋白母本单链抗体ScFv为模板,利用PCR点突变分别在重链FR可变区VH(44)和轻链FR可变区VL(100)分别引入一个半胱氨酸,成功构建了重组单链二硫键稳定抗体基因。连接pET22b( )载体,转化入E.coli BL21(DE3)得到工程菌,IPTG诱导表达。体外复性并经Ni-NTA亲和层析对目的蛋白ScdsFv进行纯化;利用荧光抗体实验和ELISA检测抗体活性及稳定性。结果表明重组ScdsFv蛋白实现了原核高效表达,通过体外复性和Ni-NTA柱纯化获得纯度大于90%的ScdsFv蛋白。荧光抗体实验和ELISA结果表明ScdsFv具有特异的抗原结合活性,与母本ScFv比较,稳定性有明显提高。这种具有特异抗原结合活性的稳定ScdsFv蛋白的获得为其进一步的功能研究提供了材料。     

aⅡbb3同源模拟和环形RGD药物小分子设计

血小板表面的整合蛋白aⅡbb3对血栓的形成具有很重要的调控作用, aⅡbb3与纤维蛋白原上的RGD特征序列结合, 促进血小板凝集进而形成血栓。这样可以在理论上设计一个环形RGD小分子(RGD-c)与aⅡbb3蛋白结合, 阻断其与纤维蛋白原的结合位点, 进而阻断血栓形成。以糖蛋白avb3(pdb 代码 1jv2)作为模板, 利用modeller8v2软件进行同源模拟得到aⅡbb3三维模型。而小分子则以RGD序列为主, 两边各加一个氨基酸X、Y, X和Y之间用一个二硫键相连, 通过改变X和Y, 重复优化过程则可得到不同的小分子模型, 将其与aⅡbb3进行分子对接, 可以找出比较理想的XY组合, 对治疗血栓的药物设计具有重要的理论指导作用