黑曲霉SL2-111复合酶固体发酵工艺研究

以酸性蛋白酶酶活为响应值,采用单因素搜索和正交试验对黑曲霉（Aspergillus niger）SL2－111固体发酵工艺进行优化,结果表明最适培养基的组成为：新鲜麸皮8．25g,米糠4．5g、豆饼粉1．5g、（NH4)2SO40.3g、K2HPO40．66g、CaCl20.075g、水8．6mL,pH5．5,变温培养,前30h28℃、后30h为23℃,培养时间为60h。采用最适培养基和优化工艺,在250mL三角瓶中进行验证实验,酸性蛋白酶酶活可达12586U/g,果胶酶和纤维素酶分别为16490U/g、9822U／g。     

可溶性尿激酶受体的表达、纯化和结晶

克隆尿激酶受体可溶区域(suPAR)到果蝇胚胎细胞分泌表达载体pMT/Bip/v5-his,重组质粒与pCoHygro共转染果蝇S2细胞,筛选多拷贝稳定表达细胞系suPARS2.suPAR表达蛋白经尿激酶N端片段亲和柱、ResourceQ阴离子交换柱两步纯化后,得到高纯度的、稳定的suPAR单体.纯化后的蛋白质,与其抗体ATN615及尿激酶N端片段结构域等摩尔混合,浓缩至10g/L,以透析法进行该三元复合物晶体生长,获得衍射分辨率为1.9#的蛋白质晶体.     

尿激酶催化结构域S356A突变体在毕氏酵母中的表达、纯化及结晶

采用定位突变和重叠延伸PCR方法扩增尿激酶催化结构域基因片段,将其克隆至表达栽体pPICZαA上,转化毕氏酵母X-33.重组蛋白通过阳离子琼脂糖柱纯化、凝胶层析柱检测,纯度达到99%以上,该重组的尿激酶催化结构域(C279A/N302Q/S356A)不具有丝氨酸蛋白酶活性.用气相扩散法获得蛋白晶体,其衍射分辨率迭1.77(A),结构解析发现在其复合物结构中有三个抑制剂分子苯甲醚.     

蛋白质二硫键异构酶的结构及抑制剂研究进展

蛋白质二硫键异构酶(PDI)可催化二硫键的形成、断裂和重排,并促进蛋白质折叠,对稳定蛋白质的三维结构至关重要. PDI的表达或酶活性的失调与一系列疾病如癌症、神经退行性疾病、血栓形成等密切相关.本文综述了PDI结构、与疾病的关系及其抑制剂的研究进展,并指出目前PDI抑制剂存在的问题及未来发展方向,以期为PDI抑制剂的进一步研究提供参考.     

整合素αMβ2 I-结构域的基因合成和蛋白表达

目的：利用大肠杆菌表达系统表达整合素αMβ2 I-结构域,并对其进行纯化。方法与结果：利用DNAWorks在线引物程序设计经过密码子优化的整合素αMβ2 I-结构域的寡核苷酸序列;采用PCR介导的基因拼装法合成αMβ2 I-结构域DNA模板,将其克隆至原核表达载体pET11d-6h上,并转化大肠杆菌,获得表达菌株;经IPTG诱导,αMβ2 I-结构域在大肠杆菌BL21（DE3）中获得高效表达,表达产物经Ni-NTA琼脂糖层析柱纯化后,纯度达到90％以上;电喷雾电离质谱测定表明纯化所得的蛋白精确的相对分子质量为23720.0,与预期值相符;肽指纹质谱图谱鉴定其为目的蛋白。结论：αMβ2 I-结构域的高效表达,为进一步研究其与配体的结合及其复合物晶体结构奠定了基础。     

尿激酶催化结构域在毕氏酵母中的表达、纯化及结晶

利用重叠延伸PCR方法扩增尿激酶催化结构域的突变体基因片段,将其克隆至表达载体pPICZαA上,转化酵母X-33,用Zeocin筛选高拷贝数的酵母菌落.重组蛋白通过阳离子琼脂糖柱纯化,纯度达到99%,该仅含尿激酶催化结构域的突变体(C279A/N302Q),无需激活即具有尿激酶活性.用气相扩散法获得蛋白质晶体,其衍射分辨率达1.45!.     

分子生物学在蛋白质结晶中的应用

获得具有高分辨率的蛋白质晶体是目前蛋白质结构测定的主要瓶颈 . 蛋白质结晶受很多因素影响,蛋白质自身是结晶时最重要的变量,可以说,蛋白质的内在特性在某种程度上决定了其能否结晶以及所得晶体分辨率的高低 . 近年来分子生物学尤其是蛋白质工程的应用有效地提高蛋白质的溶解度、均一性及可结晶性等内在特性,促进蛋白质的结晶,成为提高蛋白质结晶能力和蛋白质晶体分辨率的有效途径 .     

缺血性脑卒中溶栓药物研究进展

缺血性脑卒中是一种高发病率、高死亡率的重大健康危机。溶栓药物能快速溶解血栓、减少出血副作用、实现血管再通,对缺血性脑卒中治疗起到关键性的作用。重组组织纤溶酶原激活剂(rtPA)是FDA批准的唯一缺血性脑卒中药物,但在临床使用中有诸多限制。近年来,基于tPA的溶栓药物及治疗策略发展迅速,文中结合笔者课题组及目前国内外的相关研究成果,回顾了该领域的最新进展,为新型溶栓药物发展提供科学依据和思路。     

扩展青霉碱性脂肪酶基因在毕赤酵母中的高效表达

将编码扩展青霉碱性脂肪酶（PEL）的cDNA克隆到酵母整合型质粒pPIC3.5K,电转化His4缺陷型巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115,通过橄榄油MM平板及PCR方法筛选和鉴定重组子。重组子发酵液经SDSPAGE分析、橄榄油检验板鉴定,表明扩展青霉碱性脂肪酶基因在巴斯德毕赤酵母中获得了高效表达。表达蛋白分泌至培养基中,分子量约28kD,与扩展青霉碱性脂肪酶大小一致,占分泌蛋白的95%。橄榄油检验板检验表明该表达蛋白可分解橄榄油,通过优化该表达菌的发酵条件,以橄榄油为底物进行酶活测定,其发酵液酶活可达260 u/mL。     

扩展青霉碱性脂肪酶基因在毕赤酵母中的高效表达

将编码扩展青霉碱性脂肪酶 (PEL)的cDNA克隆到酵母整合型质粒pPIC3.5K ,电转化His4缺陷型巴斯德毕赤酵母 (Pichiapastoris)GS115 ,通过橄榄油 MM平板及PCR方法筛选和鉴定重组子。重组子发酵液经SDS PAGE分析、橄榄油检验板鉴定 ,表明扩展青霉碱性脂肪酶基因在巴斯德毕赤酵母中获得了高效表达。表达蛋白分泌至培养基中 ,分子量约 2 8kD ,与扩展青霉碱性脂肪酶大小一致 ,占分泌蛋白的 95 %。橄榄油检验板检验表明该表达蛋白可分解橄榄油 ,通过优化该表达菌的发酵条件 ,以橄榄油为底物进行酶活测定 ,其发酵液酶活可达 2 6 0u mL。