茶树TIFY基因家族鉴定及非生物胁迫下表达分析

TIFY基因家族在茶树激素信号转导及其逆境胁迫具有十分重要的作用。该文利用生物信息学方法对茶树基因组中的TIFY家族进行了鉴定,分析其理化性质、系统进化、基因结构、染色体定位、启动子区顺式作用元件、组织表达模式,并通过RT-qPCR对部分TIFY家族成员进行了非生物胁迫。结果表明:(1)茶树TIFY基因家族成员19个(CsTIFY1～CsTIFY19),分属于4个蛋白亚家族TIFY、JAZ、ZML 和 PPD,且不均匀地分布在8 条染色体上,按照进化关系及结构特点可分为 7 组,每组内具有相似的基因结构与保守基序组成。(2)CsTIFYs基因的启动子区具有多种包含激素和非生物胁迫响应的顺式作用元件,通过实时荧光定量(RT-qPCR)分析其家族成员对在茉莉酸甲酯、盐(20%氯化钠)、冷(4 ℃)以及干旱(20% PEG-6000)处理下反应强烈,部分基因在根与顶芽中有较高的表达量。由此推测,TIFY基因家族可能在茶树激素信号调控、胁迫响应、生长和发育等多方面发挥功能作用。     

茶树CsLEA5基因的克隆及表达分析

该研究以茶树‘龙井长叶’为材料,克隆获得了茶树胚胎发育晚期丰富蛋白基因CsLEA5的cDNA序列,该序列全长515 bp,包含一个375 bp的开放阅读框,编码124个氨基酸,预测蛋白分子量为13.5 kD,理论等电点为5.92。蛋白序列分析结果显示,CsLEA5为高亲水性和稳定性蛋白,且含有一个典型的LEA_3保守结构域,属于LEA蛋白中LEA_3亚家族成员。CsLEA5基因启动子区域包含多种与逆境响应相关的顺式作用元件,如乙烯响应元件（ERE）、胁迫响应元件（STRE）、创伤响应元件（WUN motif）及MYB、MYC转录因子识别位点等。qRT PCR分析显示,CsLEA5基因表达具有明显的组织特异性,在叶片中的表达量最高,其次是嫩茎,而在其他组织器官中的表达量较低,且CsLEA5基因表达受低温和干旱胁迫的诱导。研究表明,CsLEA5基因可能在茶树响应低温和干旱胁迫过程中发挥重要作用。该研究对了解茶树抗逆分子机制,筛选抗性候选基因资源提供了重要理论依据。     

刺葡萄白藜芦醇合成酶基因对不同光质的响应及转录因子筛选

为探究白藜芦醇合成酶基因(RS)的表达模式和转录调控特征,该研究以刺葡萄愈伤组织为材料,采用RT PCR方法进行RS1基因克隆,分析RS1基因在8种不同光质培养条件下的表达模式,并对靶向RS1的转录因子进行预测分析和筛选验证。结果表明：(1)成功从刺葡萄中克隆获得RS1基因(GenBank登录号为OM339527);RS1基因开放阅读框为1 179 bp,由2个外显子和1个内含子组成,编码392个氨基酸,为亲水性无信号肽的细胞质定位蛋白,磷酸化修饰主要发生于苏氨酸和丝氨酸位点上,蛋白质的二级结构主要由α 螺旋、无规则卷曲和延伸链组成。(2)RS1启动子具有多个光响应和转录因子识别与结合元件,还涉及激素调控、生长发育、环境条件响应。(3)转录调控预测发现,靶向RS1的转录因子来自9个家族,共有23个成员,其中MYB和Dof基因家族具有多个成员和RS1启动子结合位点。(4)共线性分析表明,葡萄与毛果杨的共线性最高,MYB DIV和Dof5.1具有多个共线基因。(5)转录水平分析显示,长波光促进RS1的表达,在不同光质和培养阶段下MYB DIV与靶基因RS1具有相同的表达模式,而Dof5.1的表达模式与RS1呈相反趋势,表明MYB DIV和Dof5.1分别通过正负调控参与RS1的转录表达。     

谷子PAL基因家族全基因组的鉴定和表达分析

苯丙氨酸解氢酶(phenylalanine ammonia-lyase,PAL)基因家族参与苯丙烷类代谢过程,通过调控植物抗病次生物质的合成在植物抗逆反应中发挥重要作用。为明确谷子PAL基因家族在逆境胁迫下的表达规律,该研究利用生物信息学方法对谷子PAL基因家族进行鉴定和表达分析。结果表明:谷子具有11个PAL基因,在进化树中可分为3个亚家族,SiPAL7独自进化为一支。通过构建蛋白结构域发现PAL基因家族成员均含有保守的PAL结构域。启动子分析显示,PAL基因含有应答激素、逆境胁迫等多种因子的顺式作用元件,说明PAL基因广泛参与不同生物学调控过程。RT-qPCR结果显示,谷子PAL基因家族多为诱导型表达,不同光照条件下PAL基因表达量变化明显,不同基因具有不同响应模式,说明谷子PAL基因家族在参与光调节反应中发挥重要作用。谷子PAL基因高度保守,广泛响应不同非生物胁迫,具有表达特异性。该研究结果为揭示PAL基因家族在调节谷子抗性及胁迫应答过程中的作用提供了参考。     

芥菜BjuWRKY75基因表达及其与开花整合子BjuFT互作

芥菜(Brassica juncea)是十字花科芸薹属一年或二年生蔬菜,其产品器官的产量和品质会受到开花时间的影响。WRKY家族成员具有响应生物和非生物胁迫、发育调控和信号转导等作用。WRKY75是WRKY家族中能够调节开花的重要成员,但在芥菜中的开花调控机制还未见报道。本研究克隆了芥菜BjuWRKY75基因,发现其编码蛋白具有高度保守的WRKY结构域,属于Ⅱ类WRKY蛋白,与黑芥BniWRKY75同源性最高。BjuWRKY75在花中表达丰度显著高于叶和茎,并且在叶中表达较为稳定。BjuWRKY75定位于细胞核,能够与含有W-box应答元件的开花整合子BjuFT的启动子相互作用,且能转录激活下游基因表达。BjuWRKY75转入拟南芥可显著提早开花。综上说明,BjuWRKY75能够直接靶向BjuFT从而促进开花。这为深入研究BjuWRKY75开花分子调控奠定了基础。     

多胺对盐胁迫下黄瓜SOS2基因家族表达的影响

该研究基于黄瓜基因组数据库,利用生物信息学和荧光定量PCR等方法,对黄瓜SOS2基因家族进行全基因组鉴定,并对其表达特性进行系统分析。结果表明：(1)在黄瓜基因组中,共鉴定到 15个SOS2基因(CsSOS2 1~CsSOS2 15),且不均匀分布在5条染色体上;亚细胞定位显示SOS2蛋白主要位于细胞质膜。(2)系统进化分析显示,CsSOS2 2和CsSOS2 6与AtSOS2亲缘关系更近。(3)顺式作用元件预测显示,SOS2基因启动子序列主要含有干旱诱导和防御应激响应元件。(4)结构分析显示,SOS2蛋白所含保守基序的排列顺序完全一致,且主要含有STKc和NAF保守结构域,这些结构可能在基因响应盐胁迫过程中起调控作用。(5)荧光定量试验表明,SOS2基因家族主要在黄瓜的根和叶片响应盐胁迫时上调表达,其中,盐胁迫处理1 d时有5个基因上调表达,并随处理时间延长盐胁迫下的基因表达有所下调;增施多胺显著上调了CsSOS2 1~CsSOS2 5、CsSOS2 8、CsSOS2 9、CsSOS2 12和CsSOS2 15在不同组织中的表达,说明盐胁迫下多胺能诱导黄瓜SOS2基因家族的表达,进而参与植物耐盐分子网络的调控。     

茄子TCP基因家族全基因组的鉴定与分析

TCP (teosinte branched1/cincinnata/proliferating cell factor)转录因子是植物特有转录因子家族,在植物整个生长发育过程中都有着很重要作用。目前,在茄子(Solanum melongena L.)中还没有关于TCP转录因子的相关报道。本研究利用生物信息学方法在茄子基因组数据库中鉴定出分布于11条染色体上的29个茄子TCP家族基因(eggplant TCP,SmTCP)。研究结果显示,该家族所有成员均含有编码TCP保守结构域的序列。这些成员氨基酸长度范围为201–538 aa,外显子数为1或2。亚细胞定位显示,有3个SmTCP (SmTCP02/03/21)蛋白位于细胞质中,其他SmTCP蛋白都位于细胞核中。系统发育树和序列特征分析均将29个SmTCP基因分成ClassⅠ(PCF)和ClassⅡ(CIN和CYC/TB1)两大类。共线性分析发现,17对(21个)SmTCP基因存在共线性关系,且这些存在共线性关系的基因都属于片段复制。基因表达模式分析显示,29个SmTCP基因家族成员在15个组织或器官中都有表达,但是不同成员的表达模式存在差异,其中CIN亚家族的4个基因(SmTCP18/19/20/25)在3个不同生长期的叶片中均较高表达。SmTCP启动子区域的顺式作用元件分析共发现4类顺式作用元件。本研究从多个角度分析了SmTCP基因分子基础,研究了TCP转录因子对茄子生长发育的影响,为茄子分子育种提供理论参考。     

甜菜BvHAK基因家族全基因组鉴定及其在盐处理下的表达分析

高亲和性K⁺转运蛋白（high-affinity K⁺ transporter,HAK）是植物中最重要的K⁺转运蛋白家族之一,在植物K⁺吸收和转运过程中发挥重要功能。为探究甜菜BvHAK基因家族成员生物学功能及基因表达模式,采用生物信息学手段,预测了蛋白质的理化性质、基因结构、染色体定位、系统进化、保守基序、三维结构、互作网络、启动子顺式作用元件,并通过qRT-PCR分析了盐胁迫下BvHAKs基因在甜菜不同组织中的表达水平。共鉴定出10个甜菜BvHAK基因家族成员,含有8-10个外显子、7-9个内含子;平均氨基酸个数为778.30,平均分子量为88.31 kDa,等电点为5.38-9.41,跨膜区为11-14个。BvHAK4、-5、-7和-13定位在质膜,而其余定位在液泡膜。系统进化分析发现,高等植物HAK可分为5个簇,分别为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ簇,其中Ⅱ簇成员可进一步分为Ⅱa、Ⅱb和Ⅱc等3个亚簇;BvHAK家族成员则分布在前4簇,分别含有1、6、1和2个成员。甜菜BvHAK基因家族主要含有胁迫响应元件、激素响应元件和生长发育响应元件。进一步对BvHAK基因在盐处理下甜菜不同组织中的表达模式分析发现,50和100 mmol/L NaCl不同程度地诱导甜菜地上部和根部BvHAK基因家族成员的表达;高盐（150 mmol/L）则下调了其在地上部的表达水平。这些结果表明,BvHAK基因家族在响应盐胁迫过程中起重要作用。     

白菜PLD基因家族全基因组鉴定及对高温胁迫的响应

膜磷脂是产生胞内信号信使的重要来源,磷脂酶Ds(phospholipase D,PLDs)可以催化磷脂产生信号分子磷脂酸(phosphatidic acid, PA),从而响应不同胁迫信号。该研究利用生物信息学方法对白菜PLD基因家族的基因成员进行鉴定及结构域分析,并采用qRT PCR方法对不结球白菜的18个BrPLD基因的表达进行分析,以探讨不结球白菜的BrPLD基因家族对高温胁迫的响应机制。结果表明：(1)共鉴定到18个白菜PLD基因家族成员,其中有2个成员(BrPLD03和BrPLD09)的C2结构域被替换为PH/PX结构域,另有1个基因(BrPLD12)缺少了其N末端保守结构域,由信号肽代替。(2)根据编码蛋白结构域的不同,18个BrPLD基因分为3个亚类,分别为15个C2 BrPLD、2个PH/PX BrPLD和1个SP BrPLD;氨基酸理化性质分析发现,该基因家族编码蛋白多半为酸性蛋白;18个基因分布在除4号和7号之外的8条染色体,且呈现不均匀分布,并发现了BrPLDs蛋白Ca²⁺配位碱基的缺失。(3)qRT PCR检测发现,高温处理下不结球白菜的BrPLD基因的表达量发生明显变化,各基因在耐热和热敏品种中的表达具有差异。(4)对BrPLD基因家族不同功能顺式响应元件的预测发现,所有家族基因含有光应答有关的作用元件,9个基因含有与低温有关的顺式元件,10个基因含有调控干旱相关元件,18个基因均未预测到热胁迫相关顺式响应元件。     

花生小GTP结合蛋白基因AhRabG3f启动子的盐胁迫响应元件分析

为研究花生小GTP结合蛋白基因AhRabG3f对盐胁迫响应的分子机制,文中克隆了花生AhRabG3f基因起始密码子上游1 914 bp的启动子片段(3f-P)。将该启动子5''末端截短获得5个片段(3f-P1-3f-P5),长度分别为1 729、1 379、666、510、179 bp。构建了将这6个启动子片段与gus基因融合的植物表达载体,利用农杆菌介导法转化烟草。对转基因烟草进行GUS表达分析和酶活性检测,结果表明,在转入各启动子片段的烟草中,都能检测到gus基因的表达,其中全长启动子3f-P的驱动活性最弱,而截短片段3f-P3的驱动活性最强。对转基因烟草进行盐胁迫处理后,3f-P、3f-P1、3f-P2和3f-P3所驱动GUS酶活性是未经盐诱导的3.3、1.2、1.9、1.2倍,表明AhRabG3f启动子是盐诱导型的,在3f-P至3f-P3之间可能存在对盐响应的正调控元件。通过对盐胁迫处理后各启动子片段驱动的GUS活性分析,推测在AhRabG3f启动子上游1 930–1 745 bp、682–526 bp之间存在可能对盐响应的正调控元件MYB、GT1和富含TC的重复序列,1 395–682 bp之间存在可能对盐响应的负调控元件MYC。研究结果可为利用诱导型启动子调控花生的耐盐性提供指导。     

茶树CsPLK基因的鉴定与表达分析

茶树中富含茶氨酸、儿茶素和咖啡碱等重要功能成分,具有较高的价值功效,茶树在生命周期中经常遭受逆境胁迫,维生素B6(VB6)在植物体内参与逆境应答,吡哆醛激酶(pyridoxal kinase,PLK)是VB6补救途径中的关键酶。为进一步了解PLK在茶树生物合成中的功能和作用机理,该研究基于茶树基因组数据库,以龙井43为材料,采用逆转录PCR(RT-PCR)的方法从茶树中克隆出CsPLK的基因。结果表明:该基因序列长为1 179 bp,编码393个氨基酸; CsPLK蛋白和已知物种中PLK蛋白具有较高的同源性,都是核糖激酶超家族成员;通过构建pET-CsPLK载体进行原核表达,并鉴定出重组蛋白有很强的催化活性;组织表达特异性分析表明,叶中的表达量比茎、根的高,在根中最低;荧光定量PCR表示,低温诱导CsPLK上调表达,干旱诱导CsPLK下调表达,发现该基因在茶树中有明显的逆境应答,推测CsPLK在茶树的生长发育、逆境胁迫发挥重要作用。     

Overexpression of two chrysanthemum DgDREB1 group genes causing delayed flowering or dwarfism in Arabidopsis

We isolated 13 DREB1 (dehydration responsive element binding factor 1) genes from chrysanthemum and further divided them into three groups, DgDREB1A, DgDREB1B and DgDREB1C, based on the phylogenetic analysis. Each group showed their unique expression patterns under cold, dehydration and salt stress conditions. Arabidopsis plants overexpressing DgDREB1A (1A plants) exhibited significantly stronger tolerance to freezing and drought than those overexpressing DgDREB1B (1B plants) and the control plants. In addition, 1A plants showed delayed flowering, but not dwarfism; while 1B plants showed dwarfism, but not delayed flowering. In 1A plants, the expression of three stress-related DREB1-downstream genes, COR47, COR15A, and RD29A, was strongly induced while the expression of CO and FT, two photoperiod responsive flowering-time genes, was inhibited. In 1B plants, the expression of GA2ox7, a GA-deactivation enzyme gene, was dramatically enhanced. The results above strongly suggest that members from different DgDREB1 groups may have distinct effects on plant development: DgDREB1A may be involved in photoperiod-related flowering-time determination and DgDREB1B in GA-mediated plant development.     

葡萄NIP基因家族的鉴定与表达分析

类根瘤菌26膜内在蛋白(nodulin 26 like intrinsic proteins,NIPs)是水通道蛋白的亚类,在植物营养获取和胁迫应答过程中发挥着重要作用。该研究利用多种生物信息学软件,对葡萄NIP家族基因进行分析,并采用RT PCR方法克隆得到4个NIP家族基因,利用qRT PCR方法分析非生物胁迫下NIP基因的表达特征。结果显示：(1)在葡萄基因组中,共鉴定到8个NIP基因,分布于葡萄4条染色体上,主要定位在质膜中;结构上含有6个跨膜结构域和两个典型的保守结构域NPA;氨基酸序列中存在很多个可能的磷酸化位点。(2)进化分析表明葡萄和拟南芥NIP基因具有较高的同源性,基因结构包含外显子数4~6个,保守基序种类和数量相似;基因启动子上游2 kb包含多种应答逆境和激素的顺式调控元件,其数量差异可能与基因本身功能相关。(3)NIP家族基因在不同组织中表达水平差异较大,多数成员在叶中表达水平较高,在茎中较低;成功克隆得到4个葡萄VvNIP基因,其长度分别为789 bp、606 bp、897 bp、789 bp,分别编码262、201、298、293个氨基酸。(4)qRT PCR结果显示,不同胁迫处理下NIP基因在葡萄叶片中的表达水平不同：低温处理下葡萄NIP基因大多呈显著下调表达;盐胁迫下,除VvNIP2 1、VvNIP4 2外其余家族基因均呈下调表达;干旱胁迫下VvNIP4 2显著上调。研究表明,VvNIP基因对多种胁迫均有响应,为葡萄逆境胁迫机制研究提供了参考。     

Expression of a Brassica napus heme oxygenase confers plant tolerance to mercury toxicity

Plant heme oxygenases (HOs) regulate biosynthesis of phytochrome which accounts for photo‐acceptance and ‐morphogenesis. Recent studies have demonstrated that plant HOs also regulate many other physiological processes including response to environmental stimuli. To elucidate the mechanism by which HOs regulate plant adaptation to heavy metal exposure, three novel HOs genes were isolated from rapeseed (Brassica napus) and their expression patterns were analysed. Alignment of deduced protein sequences revealed that the three BnHOs share high identity with their corresponding orthologos (AtHO1‐3) from Arabidopsis. To investigate whether the BnHO regulates plant tolerance to Hg toxicity, we constructed B. napus transgenic plants overexpressing BnHO‐1. Under Hg stress, the transgenic plants had 1.41–1.59 folds higher biomass than the untransformants. However, overexpression of BnHO‐1 resulted in less accumulation of Hg in some lines of transformants than in untransformants. The transgenic plants show lower abundance of reactive oxygen species and attenuated oxidative injury compared with the untransgenic plants. We cloned the promoter sequences of BnHO‐1 from B. napus. Analysis revealed that the 1119 bp fragment contains a conserved Cd responsive element (CdRE) and others responding to multiple environmental stimuli. Transient expression in tobacco leaves showed differential responses to heavy metals (Zn, Cu, Pb, Hg and Cd).     

The Potential ofBetv1Homologues, a Nuclear Multigene Family, as Phylogenetic Markers in Flowering Plants

Betv1homologues are a ubiquitous group of genes in flowering plants encoding a class of highly conserved defense-related proteins and containing open reading frames from 465 to 480 bp.Betv1-like genes consist of two exons interrupted by an intron of 76–359 bp, with the intron position highly conserved. The pairwisepdistance ranged from 0 to 0.583 among flowering plants. Within plant families, the ranges of thepdistance were 0–0.403, 0–0.253, and 0.011–0.369, for Apiaceae, Betulaceae, and Fabaceae, respectively. The most striking feature of thebetv1gene phylogeny was that the multiple sequences from each plant family formed a monophyletic group and sequences from each species were generally more similar to each other than those from other species. The almost exclusive paralogous relationships of genes from the same species suggested that the genes of the multigene family underwent strong concerted evolution. Phylogenies of Betulaceae and Fabaceae inferred frombetv1gene trees were generally congruent with those based on morphology and other molecules.Betv1homologues constitute potential phylogenetic markers at the intrafamilial level or among closely related families in flowering plants.     

Detection of genetic variation among micropropagated tea [Camellia sinensis (L.) O. Kuntze] by RAPD analysis

Summary Randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) techniques were applied to assess genetic instability among micropropagated tea [Camellia sinensis (L.) O. Kuntze] eultivar ‘T-78’. Out of 49 random 10-mer primers, 11 generated polymorphism in four out of 17 micropropagated plants and one mother plant. A total of 221 bands, ranging from 525 bp to 2.5 kb, were produced by the 49 primers. Twenty-four were polymorphic for those four plants. However, the remaining bands were monomorphic among all plants. Polymorphism among those four plants showed an identifical banding pattern suggesting the occurrence of a single mutation. Our results demonstrated that RAPD can be used successfully to determine the genetic instability among micropropagated plants which otherwise were morphologically indistinguishable.     

OBPC Symposium: Maize 2004 &; beyond—Plant regeneration,gene discovery,and genetic engineering of plants for crop improvement

Summary The development of robust plant regeneration technology in cereals, dicots and ornamentals that is in turn coupled to a high-frequency DNA transfer technology is reported. Transgenic cereals that include maize, Tripsacum, sorghum, Festuca and Lolium, in addition to dicots that include soybean, cotton and various ornamentals such as petunia, begonia, and geranium have been produced following either somatic embryogenesis or direct organogenesis independent of genotype. Coupled with these regeneration protocols, we have also identified several interesting genes and promoters for incorporation into various crops and ornamentals. In addition, the phenomenon of direct in vitro flowering from cotyledonary nodes in soybean is described. In in vitro flowering, the formation of a plant body is suppressed and the cells of the cotyledonary node produce complete flowers from which fertile seed is recovered. This in vitro flowering technology serves as a complementary tool to chloroplast transformation for developing a new transgenic pollen containment strategy for crop species. Recently, the center has undertaken to screen the expression response of the 24 000 Arabidopsis genes to nitric oxide. This signaling molecule upregulated 342 genes and downregulated 80 genes. The object here was to identify a population of promoters that can be manipulated by using a signaling molecule. In addition, in keeping with the mission of enhancing greenhouse profitability for North West Ohio growers, we cloned a number of genes responsive for disease resistance from ornamentals that play an important role in disease management and abiotic stress. We have constructed a plant transformation vector with CBF3 gene under the rd29A promoter for engineering cold and freezing tolerance in petunia. Leaf dises of Petunia×hybrida v26 were used for Agrobacterium-mediated transformation, and 44 hygromycin-resistant T0 plants were obtained. The presence of CBF3 gene was confirmed in all the transgenic plants by PCR and Southern analyses.