葡萄ISSR-PCR反应体系的建立与优化

采用正交设计L9(34)对影响葡萄ISSR-PCR反应体系的4个因素(dNTP、TaqDNA聚合酶、引物、模板DNA)在3个浓度水平上进行试验,并通过直观分析初步确定其反应体系;在此基础上,通过单因素试验探讨了dNTP、TaqDNA聚合酶、引物、模板DNA、退火温度及循环次数等因素或条件对葡萄ISSR-PCR扩增结果的影响,确定最佳反应水平。最终建立了葡萄ISSR-PCR扩增的最佳反应体系:在25μL的反应体系中,dNTP浓度0.2 mmol/L,TaqDNA聚合酶的用量0.5 U,引物浓度0.4mmol/L,DNA模板用量40 ng。反应程序:94℃预变性5 min;94℃变性1 min,52℃退火1 min,72℃延伸1 min 30 s,40次循环;最后72℃延伸10 min,10℃保存。     

芽孢杆菌FJAT-55034的鉴定、生长特性及对梨轮纹病菌的抑菌活性

【背景】由葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)引起的梨轮纹病是梨栽培生产中的主要病害之一,造成巨大的经济损失。【目的】对梨轮纹病菌具有较高拮抗活性的菌株FJAT-55034进行鉴定、生长特性及抑菌活性评价,为梨轮纹病的生物防治提供菌种资源。【方法】采用形态学观察、生理生化测定和16S rRNA基因序列分析进行拮抗菌株FJAT-55034的鉴定;通过生长曲线、培养温度和pH测定,研究该菌株的生长特性。采用抑菌圈法测定该菌株的抑菌谱;采用共培养、显微镜观察和果实回接,测定菌株FJAT-55034对梨轮纹病菌生长的抑制作用。【结果】拮抗菌株FJAT-55034鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)。该菌株在20-50℃(最适温度30℃)和pH 5.0-9.0 (最适pH值7.0)均能够生长,NaCl添加量为0-5%时,该菌株均能够较好地生长。菌株FJAT-55034对6种果树不同病原真菌均具有不同程度的抑制作用,抑菌圈直径范围为19.8-29.1 mm;与梨轮纹病菌共培养后,菌株FJAT-55034对菌丝生长的抑制率为77.2%。菌株FJAT-5...     

刺葡萄幼胚愈伤组织诱导及其高产原花青素细胞系筛选

以刺葡萄幼胚为材料,研究不同培养方式、培养基配方和培养条件对其愈伤组织诱导的影响,采用正交试验设计法筛选刺葡萄愈伤组织继代增殖的培养基配方,并对继代保持的培养条件和方式进行优化,同时进行了高产原花青素刺葡萄愈伤组织细胞系的筛选研究。结果表明,刺葡萄幼胚以平放的方式接种到MS＋1.0 mg·L^-1 2,4-D或MS＋1.0 mg·L^-1 2,4-D＋0.5mg·L^-1 KT的固体培养基上,在黑暗的条件下,能有效的诱导出愈伤组织,诱导效率为80%;刺葡萄愈伤组织继代增殖以MS＋1.5 mg·L^-1 2,4-D或MS＋1.5 mg·L^-1 2,4-D＋0.5 mg·L^-1 KT的固体培养基为佳,并且采用此两种培养基交替继代培养,在光照条件下能长期保持旺盛且生长一致的刺葡萄愈伤组织;筛选出了紫红色松脆状的高产原花青素的刺葡萄愈伤组织细胞系,培养35 d后每克鲜样的原花青素含量可达1 671.16μg。     

刺葡萄白藜芦醇合成酶基因对不同光质的响应及转录因子筛选

为探究白藜芦醇合成酶基因(RS)的表达模式和转录调控特征,该研究以刺葡萄愈伤组织为材料,采用RT PCR方法进行RS1基因克隆,分析RS1基因在8种不同光质培养条件下的表达模式,并对靶向RS1的转录因子进行预测分析和筛选验证。结果表明：(1)成功从刺葡萄中克隆获得RS1基因(GenBank登录号为OM339527);RS1基因开放阅读框为1 179 bp,由2个外显子和1个内含子组成,编码392个氨基酸,为亲水性无信号肽的细胞质定位蛋白,磷酸化修饰主要发生于苏氨酸和丝氨酸位点上,蛋白质的二级结构主要由α 螺旋、无规则卷曲和延伸链组成。(2)RS1启动子具有多个光响应和转录因子识别与结合元件,还涉及激素调控、生长发育、环境条件响应。(3)转录调控预测发现,靶向RS1的转录因子来自9个家族,共有23个成员,其中MYB和Dof基因家族具有多个成员和RS1启动子结合位点。(4)共线性分析表明,葡萄与毛果杨的共线性最高,MYB DIV和Dof5.1具有多个共线基因。(5)转录水平分析显示,长波光促进RS1的表达,在不同光质和培养阶段下MYB DIV与靶基因RS1具有相同的表达模式,而Dof5.1的表达模式与RS1呈相反趋势,表明MYB DIV和Dof5.1分别通过正负调控参与RS1的转录表达。     

龙眼松散型胚性愈伤组织发生过程中相关蛋白的表达分析

以龙眼‘红核子’品种(Dimocarpus longan Lour.cv.Honghezi)松散型胚性愈伤组织(FEC)为材料,采用固相双向凝胶电泳技术和质谱鉴定技术,对其生长过程中相关蛋白的表达变化进行研究。结果表明:(1)龙眼FEC生长过程中,总蛋白点数在400~800之间,蛋白点数变化虽有升降起伏,但总体呈上升趋势;蛋白质pI集中在4~7之间;蛋白质分子量在14~97kD之间,表达量相对较高的是分子量在30~66kD的蛋白质,且30~45kD的蛋白点逐渐增多,45~66kD的逐渐减少。(2)龙眼FEC生长过程中质谱鉴定66个蛋白,其中28.79%为功能未知蛋白,30.30%涉及胁迫应答和抗氧化,10.61%涉及能量和糖代谢,10.61%涉及蛋白代谢和修复,6.06%涉及细胞骨架重构,4.55%蛋白是调控蛋白,3.03%是核酸代谢相关蛋白,而所占比例最少的为信号转导与细胞凋亡相关蛋白、氨基酸代谢相关蛋白、脂类代谢相关蛋白,以及维生素代谢相关蛋白均为1.52%。(3)龙眼FEC生长过程中,胁迫反应/氧化还原相关蛋白(抗坏血酸类过氧化物酶R147、R158和HC21,苄基醚还原酶同系物TH6、谷胱甘肽过氧化酶以及过氧化物酶L26)表达高峰出现在前期10~20d,而过氧化物酶4多在后期40~50d表达;蛋白质合成及修复的相关蛋白,只有蛋白质异形体1在10~30d表达量高,其他蛋白的表达高峰出现在前期10~20d之间,能量与糖代谢相关酶在整个过程中都有较大量的表达。     

摘心对‘巨峰’葡萄生长及蔗糖和淀粉代谢的调控作用

为揭示摘心对‘巨峰’葡萄(Vitis vinifera L. × V. labrusca L. cv. Kyoho)生长发育、蔗糖和淀粉代谢的作用及其分子机理,采用不同留叶摘心,研究‘巨峰’葡萄叶片和茎段表型,果实可溶性固形物、蔗糖和淀粉积累特征,以及蔗糖和淀粉代谢相关基因的表达变化。结果表明,摘心抑制‘巨峰’葡萄叶片生长和茎段增粗,但是促进花序早期的快速增长,提高单果重、果穗重、株产量和可溶性固形物含量;2叶摘心提高生长发育后期叶片蔗糖、茎段蔗糖和淀粉的含量;2叶摘心促进蔗糖代谢基因SPS、NI、CWI的高表达,同时抑制淀粉代谢中AMY的表达。因此,2叶摘心能够调控SPS、NI、CWI和AMY基因的表达进而促进蔗糖合成和淀粉积累,为果实成熟、新梢萌芽和开花奠定营养基础。     

龙眼体胚发生相关未知蛋白DlUP-3基因的克隆与表达分析

在龙眼体胚发生早期的蛋白质组学研究中,发现1个体胚发生相关未知蛋白DlUP-3,通过简并引物结合RACE技术进行其基因全长序列克隆。结果显示:(1)克隆到的龙眼体胚发生相关未知蛋白基因DlUP-3的全长cDNA序列为1 681bp,开放阅读框由1 017个核苷酸组成,编码338个氨基酸(GenBank登录号为GQ167202)。(2)生物信息学分析发现,该基因推导蛋白分子量为36 854.2Da,pI为9.05;该蛋白为Ras蛋白质家族成员,具有ATP/GTP-binding site motif A(P-loop)结合位点和1个典型的Ras_like_GTPase superfamily组件,无典型信号肽结构,但有跨膜螺旋的亲水性蛋白;不规则卷曲是其最大量的结构元件,散布于整个蛋白质中。(3)实时荧光定量PCR分析显示,该基因在龙眼体胚发生过程中均有表达,其中以胚性愈伤组织阶段表达量最低,而球形胚阶段最高。研究表明,DlUP-3基因在龙眼体胚发生过程尤其是球形胚阶段有重要的作用,为进一步研究该基因在龙眼体胚发生过程中的功能奠定了基础。