中国大豆花叶病毒SC7外壳蛋白基因的序列测定及其与美国株系的比较

为了探索大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus,SMV)SC7外壳蛋白(Coat protein,CP)基因序列与病毒致病性作用及其与美国株系的对应关系,本研究通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR),克隆了我国SMV SC7株系的CP基因,并测定了其全序列。结果表明:CP基因长度为795bp,编码的CP蛋白为265个氨基酸。在致病性反应上,SC7的毒力比美国的毒株更强些。在分子水平上,CP基因核苷酸序列差异为4%~5%,编码的氨基酸序列差异为1%~2%。美国株系N端都存在与蚜传有关的保守基序DAG(Asp-Ala-Gl),但在SC7为DAD(Asp-AlaAsp)。将序列信息与SMV株系在鉴别寄主上的症状反应进行综合分析发现,CP基因的同源性与SMV在鉴别寄主上的致病性反应没有明显关系。     

调节性T 细胞在发热结缔组织病患者外周血中的表达及临床意义

目的:研究Treg细胞在发热CTD患者外周血表达对结核感染的诊断价值。方法:对103例发热CTD患者进行T-SPOT.TB试验,将39例阳性者设为实验组-1,进行抗结核治疗,将64例阳性者设为实验组-2,另选取40例健康者作为对照组,检测三组外周血CD4+CD25+Treg细胞、Foxp3基因、IL-10、TGF-β的表达。结果:实验组CD4+CD25+Foxp3 Treg细胞占CD4+T比例高于对照组(P0.05),实验组-1治疗前外周血CD4+CD25+Foxp3 Treg细胞占CD4+T比例高于实验组-1治疗后、实验组-2(P0.05);实验组TGF-β表达量低于对照组(P0.05),实验组-1治疗前低于实验组-1治疗后及实验组-2(P0.05);实验组-1治疗前IL-10表达量低于实验组-1治疗后、实验组-2及对照组(P0.05)。结论:CD4+CD25+Foxp3 Treg细胞在发热CTD伴有结核感染患者外周血中的表达升高,其变化可作为结核感染诊断的辅助性指标。     

番茄多胁迫诱导型LeMTshsp启动子的分子克隆及其功能分析

根据Southern杂交结果,选取KpnⅠ与EcoRⅠ双酶切番茄中蔬4号基因组DNA,3kb左右的酶切片段连入pBSⅡKS( )载体,构建成含有线粒体小分子热激蛋白基因(LeMTshsp)上游2kb左右调控区的质粒文库。通过巢式PCR方法从构建的质粒文库中克隆出LeMTshsp基因上游1915bp的调控区(GenBank登录号为AB239774)。该序列含有TATA box及CAAT box等启动子基本元件,还具有6组典型的HSE元件及多个AT-rich区,另外还有许多逆境反应元件如ABRE,C-repeat—DRE,AP-1。凝胶阻滞结果表明,纯化的HsfA2蛋白与LeMTshsp启动子的HSE元件在体外具有结合活性,且与近端5组HSE的结合活性比与远端HSE的结合活性强。构建该启动子与GUS基因的融合载体,利用农杆菌介导的叶圆盘法转化番茄,GUS组织化学染色结果表明LeMTshsp启动子对热激、低温、外源ABA及重金属胁迫都有应答。     

组织型纤溶酶原激活剂A链与尿激酶原B链嵌合分子的构建与表达

利用 Ｄ Ｎ Ａ 重组技术和定位删除技术,将组织型纤溶酶原激活剂（ｔ Ｐ Ａ）的 Ａ 链（ Ｓｅｒｌ Ｔｈｒ２６３）基因与尿激酶原（ｐｒｏ Ｕ Ｋ）的 Ｂ链（ Ｓｅｒ１３８ Ｌｅｕ４１１）基因相连,得到嵌合分子基因ｔｕ ｐａ,并在昆虫杆状病毒系统中进行表达,表达量可达 ５００ Ｉ Ｕ／ｍ ｌ．经单克隆抗体免疫亲和层析纯化细胞表达上清液,得到ｔｕ Ｐ Ａ 嵌合分子,其比活为 ２００ ０００ Ｉ Ｕ／ｍ ｇ 蛋白． Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 及 Ｗ ｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 鉴定证明此表达产物分子量约为 ６０ ｋ Ｄ,与预期值相符．纤维蛋白平板测活及纤维蛋白亲和性分析初步证明,此嵌合分子的溶纤活性与ｐｒｏ Ｕ Ｋ 相近,而纤维蛋白亲和性高于 ｐｒｏ Ｕ Ｋ．     

过量表达内质网小分子热激蛋白增强番茄的衣霉素抗性

真核细胞内质网腔内未折叠蛋白的过度积累会引起内质网胁迫（ER胁迫）,继而激活未折叠蛋白应答（UPR）信号途径,诱导内质网定位的分子伴侣的大量表达（如BiP和calnexin等）。本工作将CaMV35S启动子驱动的内质网小分子热激蛋白基因（ER-sHSP）导入番茄,发现ER-sHSP的过量表达提高了转基因番茄整株对衣霉素的抗性。衣霉素处理使未转基因番茄中BiP和calnexin基因的表达迅速升高,转基因番茄中这两个基因的表达也有增加,但表达强度明显低于未转基因番茄。说明ER-sHSP能够减轻ER胁迫,并可能参与UPR信号转导途径。     

番茄金属蛋白酶基因LeftsH6的克隆和分子特性

从热处理的番茄叶cDNA文库中分离到一个全长为2213-bp的fisH基因。该基因包括一个2019-bp的读码框,推测的蛋白前体定位到叶绿体中,序列中存在AAA结构域和Zn^2＋结合结构域等已知的金属蛋白酶PtsH家族的特征结构域。在已克隆的基因中,该ftsH与拟南芥ftsH6最近源,被命名为LefisH6（Lycopersicon esculentum filamentation temperature-sensitive H6）。体外蛋白酶活性分析结果表明,纯化的FtsH具有蛋白水解活性,能降解酪蛋白但不降解BSA;突变的FtsH（Zn^2＋结合结构域中的谷氨酸Glu^472突变为谷氨酰胺Gln）失去了体外蛋白酶活性。Southern杂交结果表明,该基因在番茄基因组中是单拷贝;Northern和Western杂交均表明该基因表达被热诱导,但其表达不被低温、干旱、盐胁迫、高光等胁迫调节。首次证明了高等植物中存在能被热诱导表达的ftsH基因。     

大豆成熟种子萌发叶片体细胞胚的高频诱导和遗传转化（英文）

目的 虽然大豆遗传转化取得了较大进展,但其转化效率仍然偏低。因此,有必要建立一个更加简单和高效的大豆转化系统。本研究的目的是以大豆成熟种子萌发产生的叶片（MSDL）为靶外植体,高频诱导和转化大豆体细胞胚（somatic embryos,SEs）。方法 萌发7 d的大豆幼苗上摘取叶片,并将其切成1.2 cm×1.2 cm的外植体。将叶片外植体置于胚胎诱导培养基（EIM）上诱导体细胞胚发生。将叶片外植体浸入携带p CAMBIA1301植物表达载体的农杆菌EHA105菌液进行遗传转化。结果 MSDL （包括初生叶和次生叶）均能被诱导产生SEs。大多数SE发生在叶片切口处。所试的不同基因型均能诱导SEs。SEs的最高诱导率为95.0%。β葡糖醛酸糖苷酶（GUS）染色结果表明,平均转化效率达到75.4%。DNA印迹（Southern blot）结果表明,目的基因稳定整合在大豆基因组中,拷贝数为1～3个。结论 本研究建立了以大豆MSDL为靶组织的体细胞胚高频诱导和遗传转化。该系统有望在大豆基因组编辑技术的开发上得到应用。     

番茄多胁迫诱导型LeMTshsp 启动子的分子克隆及其功能分析

根据Southern 杂交结果, 选取KpnⅠ与EcoRⅠ双酶切番茄中蔬4 号基因组DNA, 3 kb 左右的酶切片段连入pBSⅡKS ( + ) 载体, 构建成含有线粒体小分子热激蛋白基因( LeMTshsp) 上游2 kb 左右调控区的质粒文库。通过巢式PCR 方法从构建的质粒文库中克隆出LeMTshsp 基因上游1915 bp 的调控区( GenBank登录号为AB239774) 。该序列含有TATA box 及CAAT box 等启动子基本元件, 还具有6 组典型的HSE 元件及多个AT-rich 区, 另外还有许多逆境反应元件如ABRE , C-repeat— DRE , AP-1。凝胶阻滞结果表明, 纯化的HsfA2 蛋白与LeMTshsp 启动子的HSE 元件在体外具有结合活性, 且与近端5 组HSE 的结合活性比与远端HSE 的结合活性强。构建该启动子与GUS 基因的融合载体, 利用农杆菌介导的叶圆盘法转化番茄, GUS 组织化学染色结果表明LeMTshsp 启动子对热激、低温、外源ABA 及重金属胁迫都有应答     

番茄 calnexin 基因的克隆及胁迫表达分析

Calnexin是内质网中重要的类凝集素分子伴侣,其主要作用是辅助糖基化蛋白的折叠和装配,调节内质网中的Ca2 稳态平衡和Ca2 信号传导过程。从番茄(Lycopersicon esculentum)的cDNA文库中克隆到calnexincDNA全序列,将其命名为Lecnx61.0,并以其3’端DNA片段为探针对番茄基因组进行Southern分析,结果表明Lecnx61.0在该基因组中仅有一个拷贝;Northern和W estern分析表明,Lecnx61.0的表达还受热激、冷害、盐害和内质网应激诱导剂衣霉素的诱导,但对干旱胁迫没有明显的反应。LeCNX 61.0蛋白对Ca2 亏缺胁迫的响应呈现组织特异性,但高浓度Ca2 并不影响各组织中LeCNX 61.0蛋白的含量,实验结果表明LeCNX 61.0蛋白可能在植物抵抗特定的环境胁迫中发挥作用。     

花生小GTP结合蛋白基因AhRabG3f启动子的盐胁迫响应元件分析

为研究花生小GTP结合蛋白基因AhRabG3f对盐胁迫响应的分子机制,文中克隆了花生AhRabG3f基因起始密码子上游1 914 bp的启动子片段(3f-P)。将该启动子5''末端截短获得5个片段(3f-P1-3f-P5),长度分别为1 729、1 379、666、510、179 bp。构建了将这6个启动子片段与gus基因融合的植物表达载体,利用农杆菌介导法转化烟草。对转基因烟草进行GUS表达分析和酶活性检测,结果表明,在转入各启动子片段的烟草中,都能检测到gus基因的表达,其中全长启动子3f-P的驱动活性最弱,而截短片段3f-P3的驱动活性最强。对转基因烟草进行盐胁迫处理后,3f-P、3f-P1、3f-P2和3f-P3所驱动GUS酶活性是未经盐诱导的3.3、1.2、1.9、1.2倍,表明AhRabG3f启动子是盐诱导型的,在3f-P至3f-P3之间可能存在对盐响应的正调控元件。通过对盐胁迫处理后各启动子片段驱动的GUS活性分析,推测在AhRabG3f启动子上游1 930–1 745 bp、682–526 bp之间存在可能对盐响应的正调控元件MYB、GT1和富含TC的重复序列,1 395–682 bp之间存在可能对盐响应的负调控元件MYC。研究结果可为利用诱导型启动子调控花生的耐盐性提供指导。