猪圆环病毒II型ORF2基因在酵母中的高效分泌表达

为了建立一种简便的检测猪圆环病毒2型(PCV2)的方法,本实验将PCV2的ORF2基因片段整合到巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株X-33染色体上,构建了X-33(pPICZa-ORF2)重组工程菌.经甲醇诱导后,成功的表达出ORF2基因片段.经过Bradford 蛋白质总含量测定和凝胶薄层扫描结果表明,表达产物占重组工程菌培养上清总蛋白的58%,表达量可达47mg/ L.间接ELISA结果初步表明重组表达产物具有良好的抗原性,能够有效地区分PCV2型病毒标准阳性与阴性血清.     

猪圆环病毒II型ORF2基因在酵母中的高效分泌表达

为了建立一种简便的检测猪圆环病毒2型(PCV2)的方法,本实验将PCV2 的ORF2 基因片段整合到巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株X 33染色体上,构建了X 33(pPICZa ORF2)重组工程菌。经甲醇诱导后,成功的表达出ORF2基因片段。经过Bradford 蛋白质总含量测定和凝胶薄层扫描结果表明,表达产物占重组工程菌培养上清总蛋白的58%,表达量可达47mg/ L。间接ELISA结果初步表明重组表达产物具有良好的抗原性,能够有效地区分PCV2型病毒标准阳性与阴性血清。     

法氏囊病病毒vp2基因在酵母中的分泌表达及鉴定

应用Pichia酵母表达系统高效分泌表达了传染性传染性法氏囊病病毒vp2基因片段.首先用Primer5.0设计1对引物P1、P2,以插入IBDV vp2基因的PMD18-T-VP2载体为模板,扩增出带有终止密码子的1.4kb片段,将此片段正向亚克隆到酵母表达载体pPICZα-A上,将构建好的重组载体pPICZα-A-VP2用Sac Ⅰ内切酶线性化后,电击转化整合入Pichia PastorisX-33酵母菌,经高浓度ZeocinTM筛选、表型鉴定、诱导表达及表达产物的鉴定,得到高效表达vp2基因的酵母工程菌X-33/pPICZα-A-VP2.工程菌72h培养上清的SDS-PAGE电泳与免疫印迹结果显示,vp2基因表达产物大小约为55 kDa,比预期的41kDa大.凝胶薄层扫描结合Bradford蛋白质总含量测定结果表明,表达产物占工程菌培养上清总蛋白的28%,表达量可达23 mg/L.间接ELISA结果表明重组表达产物能够有效地区分法氏囊病病毒标准阳性与阴性血清.     

法氏囊病病毒vp2基因在酵母中的分泌表达及鉴定

应用Pichia酵母表达系统高效分泌表达了传染性传染性法氏囊病病毒vp2基因片段。首先用Primer5．0设计1对引物P1、P2,以插入IBDV vp2基因的PMDl8-T-VP2载体为模板,扩增出带有终止密码子的1.4kb片段,将此片段正向亚克隆到酵母表达载体pPICZα-A上,将构建好的重组载体pPICZα-A-VP2用Sac Ⅰ内切酶线性化后,电击转化整合入Pichia PastorisX-33酵母菌,经高浓度Zeocin^TM筛选、表型鉴定、诱导表达及表达产物的鉴定,得到高效表达vp2基因的酵母工程菌X-33／pPICZα-A-VP2。工程菌72h培养上清的SDS-PAGE电泳与免疫印迹结果显示,vp2基因表达产物大小约为55kDa,比预期的41kDa大。凝胶薄层扫描结合Bradford蛋白质总含量测定结果表明,表达产物占工程菌培养上清总蛋白的28％,表达量可达23mg／L。间接ELISA结果表明重组表达产物能够有效地区分法氏囊病病毒标准阳性与阴性血清。     

PRRSV—PCV2重组病毒的构建及PRRSV转录调控机制研究

目的 本研究旨在探讨猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染性cDNA克隆作为猪圆环病毒(PCV2)的主要免疫原开放阅读框架2(ORF2)表达载体的可行性,以及利用重组病毒对PRRSV复制转录过程进行解剖.方法 以北美株PRRSV感染性克隆pAPRRS为平台进行反向遗传操作,分别在pAPRRS的ORF1和ORF2间,ORF5和ORF6间,ORF6和ORF7间插入PCV2 ORF2,且对拯救病毒vPCV进行了病毒学及分子生物学鉴定.结果 vPCV的sgmRNA2.1利用了PRRSV mRNA2的转录调控序列(TRS),形成由PRRSV GP2和PCV2衣壳蛋白组成的sgmRNA2.1.外源基因的插入同时也导致重组病毒启用新的TRS 而产生3条新亚基因组,其中sgmRNA2.2和sgmRNA2.3采用PCV2上的序列来取代PRRSV RNA2本身的TRS;另一条sgmRNA2.4则为非经典型亚基因组,其TRS在PRRSV相应的AUG下游.结论 2株PRRSV-PCV2重组病毒可以稳定传代,为进一步研发PRRSV遗传标疫苗奠定了基础;插入片段上一些类似TRS序列的引入及插入片段(718bp)过长导致PRRSV ORF2 TRS 本身和其两翼序列的RNA结构变化是引起重组病毒遗传不稳定性的最主要原因;PRRSV可以利用TRS样外源序列作为转录启动子,这为进一步解剖PRRSV复制转录过程奠定了基础.     

猪2型圆环病毒ORF1与ORF2基因和伪狂犬病毒基因的重组与表达的研究

根据GenBank发布的猪2型圆环病毒(PCV2 )序列(AY0 35 82 0 ) ,设计两对特异性引物,采用PCR方法,分别扩增了猪2型圆环病毒ORF1和ORF2基因。将ORF1和ORF2基因的PCR产物回收并酶切后,依次插入到伪狂犬病毒gE gI双缺失通用转移载体pIECMV中,构建了猪2型圆环病毒_伪狂犬病毒重组中间转移质粒pIEORF1-ORF2。采用脂质体介导法,将重组中间转移质粒pIEORF1_ORF2与伪狂犬病毒TK^- gE^- LacZ⁺ 基因组共转染IBRS_2细胞,待发生细胞病变后收集病毒液进行空斑纯化,利用检测PCV2ORF1基因和ORF2基因的PCR方法筛选重组病毒TK^- gE^- gI^- ORF1-ORF2⁺ ,用Southernblotting鉴定重组病毒,并用Westernblotting检测ORF1_ORF2融合蛋白的表达情况,在此基础上也测定了重组病毒在不同细胞上的增殖滴度。结果表明,外源基因ORF1和ORF2已成功插入到TK^- gE^- LacZ⁺ 亲本株的基因组中,并获得了表达,表达的蛋白可与PCV2阳性血清发生反应。同时发现ORF1和ORF2基因的插入不影响重组病毒的增殖特性,其毒力与亲本株相当。     

表达猪圆环病毒II型ORF2基因的重组猪伪狂犬病病毒的免疫原性

摘要:【目的】为研制预防猪圆环病毒II型(PCV2)感染的重组伪狂犬病病毒(PRV)活载体疫苗。【方法】将PCV2 ORF2基因插入到PRV通用载体pG中,利用脂质体LipofectamineTM 2000试剂盒将重组转移质粒pGO与猪PRV弱毒HB98株DNA共转染猪睾丸(ST)细胞,通过3轮蚀斑纯化重组病毒。将重组病毒、商品化PCV2灭活苗及DMEM培养液分别免疫6周龄雌性昆明小鼠,4周后加强免疫1次,首免后第8周用PCV2强毒NY株对小鼠进行攻毒。【结果】成功获得表达ORF2基因的重组病毒PGO,首免重组病毒后小 鼠体内抗PCV2的ELISA抗体水平很低,二免后小鼠PCV2特异的ELISA抗体水平明显升高,并且重组病毒组能够激发PCV2特异的淋巴细胞增殖效应。攻毒试验表明重组病毒组和PCV2灭活疫苗组均能有效抵抗PCV2强毒攻击。【结论】表明表达ORF2基因的重组病毒PGO具有良好免疫原性。     

表达猪圆环病毒Ⅱ型ORF2基因的重组猪伪狂犬病病毒的免疫原性

【目的】为研制预防猪圆环病毒II型(PCV2)感染的重组伪狂犬病病毒(PRV)活载体疫苗。【方法】将PCV2 ORF2基因插入到PRV通用载体pG中,利用脂质体LipofectamineTM2000试剂盒将重组转移质粒pGO与猪PRV弱毒HB98株DNA共转染猪睾丸(ST)细胞,通过3轮蚀斑纯化重组病毒。将重组病毒、商品化PCV2灭活苗及DMEM培养液分别免疫6周龄雌性昆明小鼠,4周后加强免疫1次,首免后第8周用PCV2强毒NY株对小鼠进行攻毒。【结果】成功获得表达ORF2基因的重组病毒PGO,首免重组病毒后小鼠体内抗PCV2的ELISA抗体水平很低,二免后小鼠PCV2特异的ELISA抗体水平明显升高,并且重组病毒组能够激发PCV2特异的淋巴细胞增殖效应。攻毒试验表明重组病毒组和PCV2灭活疫苗组均能有效抵抗PCV2强毒攻击。【结论】表明表达ORF2基因的重组病毒PGO具有良好免疫原性。     

PRRSV-PCV2重组病毒的构建及PRRSV转录调控机制的研究

目的 本研究旨在探讨猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染性cDNA克隆作为猪圆环病毒(PCV2)的主要免疫原开放阅读框架2(ORF2)表达载体的可行性,以及利用重组病毒对PRRSV复制转录过程进行解剖。方法 以北美株PRRSV感染性克隆pAPRRS为平台进行反向遗传操作,分别在pAPRRS的ORF1和ORF2间,ORF5和ORF6间,ORF6和ORF7间插入PCV2ORF2,且对拯救病毒vPCV进行了病毒学及分子生物学鉴定。结果 vPCV的sg mRNA2.1利用了PRRSV mRNA2的转录调控序列(TRS),形成由PRRSVGP2和PCV2衣壳蛋白组成的sgm RNA2.1。外源基因的插入同时也导致重组病毒启用新的TRS而产生3条新亚基因组,其中sgm RNA2.2和sgm RNA2.3采用PCV2上的序列来取代PRRSVRNA2本身的TRS;另一条sgm RNA2.4则为非经典型亚基因组,其TRS在PRRSV相应的AUG下游。结论 2株PRRSV-PCV2重组病毒可以稳定传代,为进一步研发PRRSV遗传标疫苗奠定了基础;插入片段上一些类似TRS序列的引入及插入片段(718bp)过长导致PRRSV ORF2 TRS 本身和其两翼序列的RNA结构变化是引起重组病毒遗传不稳定性的最主要原因; PRRSV可以利用TRS样外源序列作为转录启动子,这为进一步解剖PRRSV复制转录过程奠定了基础。     

嵌合猪圆环病毒PCV1-2的构建及其感染性初步鉴定

猪Ⅱ型圆环病毒(PCV2)是当前严重危害养猪业的重要病原之一。目前,世界上还没有有效疫苗用于该病毒的免疫预防。该研究利用PCR方法,将PCV2的ORF2基因替换猪Ⅰ型圆环病毒(PCV1)的ORF2基因,构建了以PCV1基因组为骨架的嵌合病毒(PCV1-2)分子克隆(pSK2PCV1-2)。将该分子克隆转染PK-15细胞并连续盲传5代,用RT-PCR方法可以在转染后盲传的细胞中检测到PCV1的ORF1 mRNA和PCV2的ORF2 mRNA,但检测不到PCV1的ORF2 mRNA和PCV2的ORF1 mRNA。间接免疫荧光检测显示在盲传第5代的细胞中有PCV2 ORF2蛋白的表达,表达蛋白主要分布于细胞核。该研究初步证实构建的PCV1-2分子克隆转染细胞后可以形成具有感染性的嵌合病毒,从而为更深入研究嵌合病毒生物学特性奠定了基础。     

伪狂犬病病毒闽A株gE基因去信号肽片段在Pichia pastoris中的表达

伪狂犬病病毒囊膜糖蛋白E是一种在伪狂犬病根除计划中具有重要作用的糖蛋白.将伪狂犬病病毒闽A株gE基因去信号肽片段克隆到巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pPICZαA中,获得的重组表达载体pPICZαA-FL电击转化野生型酵母菌SMD1168后,得到多株酵母工程菌SMD1168/pPICZαA-FL.经高浓度ZeocinTM筛选、表型鉴定、工程菌的诱导表达及表达产物的鉴定,最后得到高效表达gE基因去信号肽片段的酵母工程菌SMD1168/pPICZαA-FL-7.工程菌72 h培养上清的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳与蛋白质印迹结果显示,gE基因去信号肽片段表达产物大小约为80 ku,比预期的63.8 ku大.凝胶薄层扫描结合Bradford蛋白质总含量测定结果表明,表达产物占工程菌培养上清总蛋白的13.49%,表达量可达11.7 mg/L.间接ELISA结果表明重组表达产物具有良好的抗原性,能够有效地区分伪狂犬病病毒gE标准阳性与阴性血清.     

猪2型圆环病毒ORF2基因在塞姆利基森林病毒RNA复制子衍生的新型真核表达载体中的表达

猪 2型圆环病毒 (porcinecircovirus 2 ,PCV2 )是断乳仔猪多系统衰竭综合征 (postweaningmultisystemicwastingsyndrome,PMWS)的原发性病原。PCV2的ORF2编码病毒唯一的结构蛋白Cap。根据GenBank中公布的PCV2JXL株的序列设计一对引物 ,应用PCR方法从该毒株感染的PK 15细胞中扩增出完整的ORF2基因 ,将此基因克隆于本实验室此前构建的塞姆利基森林病毒 (SemlikiForestvirus,SFV)RNA复制子衍生的新型真核表达载体Psfv1cs中的BamHⅠ位点 ,获得重组质粒pSFV1CS Cap。用pSFV1CS-Cap分别转染BHK-21细胞和293T细胞 ,经间接免疫荧光试验检测表明 ,PCV2 ORF2基因在转染细胞中得到表达。小鼠接种试验表明 ,该重组质粒能诱导小鼠产生特异性抗体.     

猪圆环病毒2型ORF2基因序列分析及真核表达载体的构建

根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2基因序列,设计一对引物,应用PCR从疑患断奶仔猪多系统消耗综合症(PMWS)的死亡仔猪组织病料中扩增出ORF2全基因(702bp).将此片段克隆入pGEM-T easy载体,筛选获得重组质粒pTORF2,并对此质粒中的插入序列进行了测序分析,结果表明本试验克隆的ORF2与美国PCV-2分离株AF264039的核苷酸及氨基酸序列同源性均达到100%,与其他PCV-2毒株同源性分别为92.3%～98 6%和92.3%～96.6%.重组质粒pTORF2经BamH I、EcoR V双酶切,回收ORF2基因,转移入真核表达载体pSec-Tag2/HygroB的相应酶切位点之间,构建成重组质粒pSecTagORF2.此重组表达载体的构建成功为进一步研究ORF2编码蛋白的生物学活性及建立PCV诊断试剂盒打下基础.     

猪圆环病毒Ⅱ型Cap蛋白重组腺病毒的构建与鉴定

猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)是近年来新发现的引起仔猪多系统衰弱综合症的必需病原,含有两个主要的阅读框ORF1和ORF2,分别编码复制相关蛋白(Rep)和核衣壳蛋白(Cap),其中Cap含有病毒主要抗原表位,是研究PCV2基因工程苗的主要候选目的基因.本研究利用PCR技术将Cap蛋白基因克隆入人5型腺病毒穿梭载体(pShuttle-CMV),与腺病毒骨架载体(pAdEasyTM)共转化大肠杆菌BJ5183进行同源重组并转染HEK-293A细胞,经多次亚克隆获得了重组腺病毒rAd-Cap,测定其TCID50为1013 7/mL.用RT-PCR、间接ELISA、Western blot和IPMA等方法证明了Cap蛋白在腺病毒中获得表达.该研究为发展PCV2的重组腺病毒基因工程疫苗奠定了基础.     

表达猪圆环病毒2型ORF2基因的重组脑心肌炎病毒的构建与鉴定

以脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)作为病毒载体,寻找基因组里理想的外源基因插入位点,为构建多价疫苗奠定基础。猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)感染可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征等多种疾病。脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)宿主谱广,能够天然感染多种哺乳动物。本研究采用EMCV NJ08毒株cDNA感染性克隆,将PCV2ORF2基因插入EMCV L蛋白基因第6位及第7位氨基酸之间,拯救获得重组EMCV rNJ08/Cap,拯救病毒含有分子遗传标记。Western Blot和IFA结果显示,该重组病毒成功表达Cap蛋白。重组病毒rNJ08/Cap在BHK-21细胞上生长曲线和病毒蚀斑大小与亲本病毒NJ08相似,证明EMCV可以作为表达外源基因的病毒载体,为PCV2和EMCV疫苗研究奠定了重要基础。     

伪狂犬病病毒闽A株gE基因去信号肽片段在Pichia pastoris中的表达

伪狂犬病病毒囊膜糖蛋白E是一种在伪狂犬病根除计划中具有重要作用的糖蛋白.将伪狂犬病病毒闽A株gE基因去信号肽片段克隆到巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）表达载体pPICZαA中,获得的重组表达载体pPICZαA-FL电击转化野生型酵母菌SMD1168后,得到多株酵母工程菌SMD1168/pPICZαA-FL.经高浓度Zeocin^TM筛选、表型鉴定、工程菌的诱导表达及表达产物的鉴定,最后得到高效表达gE基因去信号肽片段的酵母工程菌SMD1168/pPICZαA-FL-7.工程菌72 h培养上清的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳与蛋白质印迹结果显示,gE基因去信号肽片段表达产物大小约为80 ku,比预期的63.8 ku大.凝胶薄层扫描结合Bradford蛋白质总含量测定结果表明,表达产物占工程菌培养上清总蛋白的13.49%,表达量可达11.7 mg/L.间接ELISA结果表明重组表达产物具有良好的抗原性,能够有效地区分伪狂犬病病毒gE标准阳性与阴性血清.     

猪圆环病毒Ⅱ型Cap蛋白重组腺病毒的构建与鉴定

猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)是近年来新发现的引起仔猪多系统衰弱综合症的必需病原,含有两个主要的阅读框ORF1和ORF2,分别编码复制相关蛋白(Rep)和核衣壳蛋白(Cap),其中Cap含有病毒主要抗原表位,是研究PCV2基因工程苗的主要候选目的基因。本研究利用PCR技术将Cap蛋白基因克隆入人5型腺病毒穿梭载体(pShuttle-CMV),与腺病毒骨架载体(pAdEasyTM)共转化大肠杆菌BJ5183进行同源重组并转染HEK-293A细胞,经多次亚克隆获得了重组腺病毒rAd-Cap,测定其TCID50为1013.7/mL。用RT-PCR、间接ELISA、Westernblot和IPMA等方法证明了Cap蛋白在腺病毒中获得表达。该研究为发展PCV2的重组腺病毒基因工程疫苗奠定了基础。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达及在小鼠体内免疫特性研究

猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白基因是该病毒基因工程疫苗的重要目的基因,但其在大肠杆菌表达系统中的表达产物通常以包涵体形式存在,影响其作为亚单位疫苗使用的免疫保护作用。将ORF2基因密码子改造为大肠杆菌偏爱的密码子,或构建MPG与ORF2基因融合,分别克隆至表达载体pET28a,再转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达。SDS-PAGE和Western blot结果证实改造后的PCV2 Cap蛋白基因实现了可溶性表达。将上述两种重组蛋白纯化后,分别与GEL01、ISA206或ISA15A三种佐剂混合配制疫苗,小鼠免疫保护试验结果证明,以GEL01为佐剂的两免疫组PCV2 ELISA抗体和中和抗体水平最高。攻毒试验结果显示,除ISA15A组外,其他各免疫组脾脏中 PCV2 含量都显著低于非免疫对照组,表明两种重组蛋白与佐剂GEL01和ISA206制成的疫苗可诱导产生一定水平的免疫保护作用,为PCV2亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

猪2型圆环病毒原核表达产物的免疫原性测定

目的检测猪2型圆环病毒(PCV2)全基因组原核表达产物的免疫原性。方法根据PCV2JXL株序列(GenBank登录号AY491310),设计合成引物,利用多聚酶链式反应(PCR)从含有PCV2接种猪肾细胞PK15中扩增了Cap蛋白的氨基端片段(737-421nt),克隆入上游带有谷光苷肽-S-转移酶的原核表达载体pGEX-6p-1中,获得重组质粒pGEX-PCV737-421。PCV2Cap蛋白羧基端(426-37nt)和Rep蛋白已在过去的研究中分别融合表达。利用IPTG对3种重组大肠杆菌BL21进行诱导,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析(SDS-PAGE)以及对PCV2阳性猪多抗血清的蛋白免疫印迹试验,在此基础上,将3种SDS-PAGE分离粗纯的重组表达产物碾碎后分别免疫BALB/c小鼠,用获得的抗鼠血清与PCV2病毒感染PK15细胞做间接免疫荧光抗体试验(IFA)。结果PCV2Cap蛋白的氨基端片段能在大肠杆菌中表达,且Cap蛋白羧基端和Rep蛋白的原核表达产物都能在免疫印迹试验中被PCV2阳性猪血清检测出特异性条带,重组蛋白免疫鼠血清可在IFA试验中观察到特异性的荧光分布,即检测到培养细胞中的病毒抗原。结论PCV2全基因组都可以用原核系统高效表达,且表达产物具有免疫原性。     

猪Ⅱ型圆环病毒ORF2与猪GM-CSF基因重组腺病毒共表达及免疫效果分析

旨在构建含融合基因pGMCSF-ORF2的重组腺病毒,并对其表达水平和免疫效果进行分析.运用PCR方法扩增PCV2 ORF2和pGM-CSF基因,拼接后克隆入pMD18-T载体,然后再亚克隆入腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV中,阳性穿梭质粒经PmeⅠ酶线性化后电转化含腺病毒基因组(AdEasy-1)的大肠杆菌细胞BJ5183-Ad-1,成功获得了重组腺病毒DNA.将纯化后的重组腺病毒DNA转染AD293细胞,经过病毒基因组的PCR和转录水平的RT-PCR及Western blot等方面对融合蛋白的表达进行了鉴定.以该病毒免疫Babl/c小白鼠,对免疫小鼠血清中PCV2抗体进行检测.结果显示,获得了pGMCSF-ORF2重组基因,重组腺病毒载体构建成功,获得了表达pGMCSF-ORF2融合蛋白的重组腺病毒.该病毒免疫小鼠后,在小鼠血清中检测到了PCV2的特异性抗体.获得的重组腺病毒能有效表达pGMCSF-ORF2融合蛋白,且可诱导小鼠产生针对PCV2的特异性抗体.