仙台病毒核衣壳蛋白基因的克隆与原核表达

目的利用原核表达系统表达仙台病毒(Sendai Virus,SV)核衣壳蛋白。方法根据GenBank上发表的仙台病毒(Sendai Virus,SV)核衣壳蛋白基因序列,设计并合成一对引物,通过RT-PCR扩增出核衣壳蛋白全长cDNA序列,将其克隆至原核表达载体pET-30a,转化大肠杆菌BL21(DE3)PlysS,于37℃1mmol/LIPTG条件下诱导表达,大肠杆菌裂解物经SDS-PAGE分析,在相对分子质量约60×103处出现一新蛋白带,与预期目的蛋白分子量相符。结果Western blot检测表明,表达产物能与兔抗SV阳性血清发生特异性反应,出现单一反应带,表明其具有免疫原性。结论为建立以重组NP蛋白为诊断抗原检测SV奠定基础。     

兔出血症病毒VP60基因在昆虫细胞中形成病毒样颗粒及其特性

目的将兔出血症病毒（RHDV）VP60全长基因在昆虫细胞-杆状病毒系统中表达,验证重组蛋白形成病毒样颗粒（VLPs）的能力及其生物学特性,探讨VLPs作为检测抗原及亚单位疫苗的潜力。方法用Bac-to-Bac系统体外表达RHDVVP60全长基因。以免疫荧光及Western blotting检测蛋白表达情况及确定蛋白最佳表达条件;免疫电镜观察VLPs形态,并对VLPs的血凝性、免疫原性进行检测。结果SDS-PAGE电泳分析表明,表达的重组蛋白分子量大小约为68KDa,在免疫荧光、琼脂扩散、ELISA试验中均与RHD多克隆抗血清特异性反应;接种重组病毒的Sf9细胞裂解液在电镜下可观察到与RHDV形态相似的VLPs;该VLPs可凝集人“O”、“B”型红细胞,凝集可被RHD多克隆抗血清所抑制;含VLPs的Sf9细胞裂解液可不经纯化用作间接ELISA抗原,所建立的ELISA方法与进口商品化试剂盒相比,特异性良好,敏感性、检出率稍低;将含VLPs的细胞裂解液加氟氏佐剂免疫兔,HI效价可达1∶40,可经受致死量病毒攻击。结论RHDV-VLPs的获得及其良好的免疫原性,为RHD血清学检测试剂的标准化、亚单位疫苗研制应用奠定基础,同时在转移载体及RHDV受体方面研究亦有潜在应用价值。     

鸡β-肌动蛋白第一内含子对EIAV转移载体外源蛋白表达能力的影响

以马传染性贫血病毒（equine infectious anemia virus, EIAV）基因转移载体pcPPTWPRE为基础,用含不同长度片段的鸡β-肌动蛋白启动子替换原有的人巨细胞病毒立即早期启动子（CMVIEp）启动外源基因的表达,分别构建了2个基因转移载体,含部分第一内含子的pWCAGP0.8和含全长内含子的pWCAGP1.6。连同在其它研究中构建的不含内含子的质粒pcPPTWCAG（另文发表）,采用磷酸钙法分别转染HEK293细胞和DF-1细胞, 利用荧光显微镜观察报告基因eGFP蛋白的表达。并利用流式细胞仪定量。统计学分析结果表明,在HEK293细胞中,pcPPTWCAG、pWCAGP0.8和 pWCAGP1.6表达阳性率分别为47.9%、46.1%和23.8%,转染后48h,收获细胞,利用流式细胞仪比较转染细胞中EGFP表达阳性细胞的百分率。结果表明,在HEK293细胞中,pcPPTWCAG、pWCAGP0.8 和pWCAGP1.6的阳性细胞分别占计数细胞的47.9%、46.1%和23.8%;在DF-1细胞中,依次分别为12.4%、9.5%和4.2%,pcPPTWCAG与pWCAGP1.6差异显著。本研究表明不含内含子的EIAV载体质粒表达EGFP的能力高于含部分和全长内含子的载体。     

HBK-SPF鸭主要解剖数据的测定

目的分别测定7日龄和56日龄的HBK-SPF鸭的解剖学数据,并分析比较性别之间的差异。方法采用常规方法测定7日龄和56日龄的雌、雄HBK-SPF鸭的解剖数据,并对雌雄差异进行了统计学分析。结果在所测定的解剖数据中,不同日龄、性别之间表现差异显著性的项目不同,其中7日龄时,左肾、右肾存在性别差异,达到极显著（P〈0.01）,胫围和盲肠2存在显著性别差异（P〈0.05）;56日龄时,只有胸腺存在极显著性别差异（P〈0.01）,盲肠1和直肠差异显著（P〈0.05）,其它解剖数据在雌雄之间差异不显著。结论不同日龄的HBK-SPF鸭的解剖数据和脏器参数存在性别差异。     

不同周龄BWEL-SPF种鸡生理生化指标的测定

目的测定不同周龄的BWEL-SPF种鸡生理和生化指标,并对测定值进行t-检验。方法分别采用计数板法、血涂片法、血液全自动分析仪测定法、双缩尿法、溴甲酚绿法、酶比色法和硫氰酸汞比色法等测定了10、40和60周龄的雌、雄BWEL-SPF种鸡的生理生化指标,并对雌、雄差异进行了统计学分析。结果在所测定的生理生化指标中,不同周龄雌雄之间差异显著性表现项目不同,其中在10周龄时,只有总胆固醇（CHO）在雌、雄之间差异极显著（P〈0．01）;40周龄时,甘油三酯（TG）、在雌、雄之间差异极显著（P〈0．01）;总胆固醇（CHO）为雌、雄之间差异显著（P〈0．05）;60周龄时,出血时间（BT）、嗜碱性粒细胞（B）、单核细胞（M）、谷丙转氨酶（ALT）、葡萄糖（Glu）在雌、雄之间差异极显著（P〈0．01）,而凝血时间（CT）和甘油三酯（TG）在雌、雄之间差异显著（P〈0．05）．除此以外,其它生理生化指标在雌雄之间差异不显著。结论BWEL-SPF种鸡的生理和生化指标随周龄不同,在雌、雄之间的差异随之变化。     

猪2型圆环病毒原核表达产物的免疫原性测定

目的检测猪2型圆环病毒(PCV2)全基因组原核表达产物的免疫原性。方法根据PCV2JXL株序列(GenBank登录号AY491310),设计合成引物,利用多聚酶链式反应(PCR)从含有PCV2接种猪肾细胞PK15中扩增了Cap蛋白的氨基端片段(737-421nt),克隆入上游带有谷光苷肽-S-转移酶的原核表达载体pGEX-6p-1中,获得重组质粒pGEX-PCV737-421。PCV2Cap蛋白羧基端(426-37nt)和Rep蛋白已在过去的研究中分别融合表达。利用IPTG对3种重组大肠杆菌BL21进行诱导,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析(SDS-PAGE)以及对PCV2阳性猪多抗血清的蛋白免疫印迹试验,在此基础上,将3种SDS-PAGE分离粗纯的重组表达产物碾碎后分别免疫BALB/c小鼠,用获得的抗鼠血清与PCV2病毒感染PK15细胞做间接免疫荧光抗体试验(IFA)。结果PCV2Cap蛋白的氨基端片段能在大肠杆菌中表达,且Cap蛋白羧基端和Rep蛋白的原核表达产物都能在免疫印迹试验中被PCV2阳性猪血清检测出特异性条带,重组蛋白免疫鼠血清可在IFA试验中观察到特异性的荧光分布,即检测到培养细胞中的病毒抗原。结论PCV2全基因组都可以用原核系统高效表达,且表达产物具有免疫原性。     

40周HBK-SPF鸭胃肠道5-羟色胺细胞的免疫组织化学定位

目的应用5-HT抗血清研究40周HBK-SPF鸭胃肠道内的5-HT免疫活性细胞的分布密度及形态,并探讨其分布型的成因及细胞形态与功能的关系。方法免疫组织化学ABC法。结果5-HT细胞主要分布于十二指肠及其以下部位,腺胃偶见,分布密度近似呈波浪形,其中以直肠分布密度最高,小肠呈U形分布。5-HT细胞的形态多样,呈圆形、椭圆形、锥体形等,主要分布于胃肠粘膜上皮之间、上皮基部、固有膜以及腺泡上皮之间等。结论40周HBK—SPF鸭5-HT细胞分布型的形成与各部位消化功能有关;根据其形态,我们认为40周HBK—SPF鸭胃肠道内5-HT细胞具有内、外分泌两种功能。     

正廿面体病毒的圆球度及其与等效球间关系的研究

本文根据形态计量学原理,对正廿面体病毒的圆球度进行了推导和计算．同时揭示了病毒内部各种等效球间的关系是按等比级数排列的,其比值近似等于廿面体圆球度（Φ）,即0.9552．     

黑龙江省实验大鼠遗传学概貌分析

目的对送检的黑龙江省生产的实验大鼠遗传概貌进行分析。方法参照国家标准《实验动物近交系小鼠、大鼠生化标记检测方法》GB/T14927.1-2001,应用乙酸纤维素板,利用Akp1、Es1、Es3、Es4、Es6、Es8、Es9和Es10等8种同工酶位点,对来自编号分别为2011、2014、3026、8028和8029的5个单位的SD、Wistar、DA、PVG等4个品系的25只实验大鼠,进行生化标记位点的检测。结果除单位2014的SD大鼠在Es3存在a和b两种带型,8028和8029未检测Es10、2014和3026未检测Es6,8,9,其余各单位的大鼠在8个位点都表现出相同的带型。结论送检的黑龙江省生产的SD和Wistar大鼠符合封闭群遗传学概貌;DA和PVG大鼠样品间带型一致。     

多杀性巴氏杆菌aroA基因缺失突变株的构建及鉴定

【目的】构建多杀性巴氏杆菌aroA基因缺失突变株,并验证其致病性。【方法】采用正向筛选同源重组技术构建多杀性巴氏杆菌aroA基因缺失突变株,利用PCR对突变株进行鉴定,分析其遗传稳定性、生长特性和致病性。【结果】成功构建多杀性巴氏杆菌aroA基因缺失突变株,连续传代20代,遗传稳定;突变株体外生长曲线表明,在前6h生长速度稍慢于亲本菌,随后两者生长速度一致。对小鼠的致病性试验表明:经腹腔注射aroA基因缺失突变株在1.0×106 CFU对小鼠无致死性,而亲本菌株在1.0×102 CFU对小鼠是致死性的。【结论】本研究获得多杀性巴氏杆菌aroA基因缺失突变株,对小鼠的致病性是减弱的。多杀性巴氏杆菌突变株的构建有助于研究其致病机理。