表达鸡传染性支气管炎病毒JS/95/03株S1蛋白的重组杆状病毒构建

The recombinant baculovirus expressing S1 glycoprotein of nephropathogenic strain JS/95/03 of infectious bronchitis virus was generated by using the Bac-to-Bac baculovirus expression system.The BamH I-Sal Ⅰ fragment containing S1 gene from the recombinant plasmid pMDJS9503S1 was purified and cloned in frame into the baculovirus transposing vector pFASTBAC HTa under the polyhedrin gene promoter.The recombinant transposing plasmid pFASTJS9503S1 was screened and then transformed into Escherichia coli DH10BAC.The resulting recombinant bacmid rBacmidJS9503S1 was transfected into cells of the insect Spodoptera frugiperda(Sf9)and the recombinant baculoviruse rAcJS9503S1 was obtained.The lysates of cells infected with rAcJS9503S1 were analyzed by SDS-PAGE and the expressed product of S1 gene was detected by Western bloting and immunofluorescence assay(IFA).The results showed the recombinant baculovirus was fully capable of expressing S1 glycoprotein of JS/95/03.Maybe owing to the incomplete glycosylation in insect cells,the S1 gene product had a Mr of only 61000.In immunofluorescence test and Western blotting,the expressed product could react with polycolonal antibody against IBV M41 strain,indicating it possessed the antigenic properties specific for native S1 glycoprotein.     

PRRSV NJ-a株ORF5基因A表位的修饰与糖基化位点的突变对其DNA疫苗免疫效力的影响

为了提高PRRSV ORF5基因的免疫效力,对ORF5基因进行了改造,将CpG序列和通用型辅助性T淋巴细胞表位插入A表位与B表位之间,并对N33与N51位糖基化位点进行了点突变,获得改造的ORF5基因。在此基础上构建了由两个CMV启动子调控的共表达改造的ORF5(MORF5)与ORF6基因的真核表达质粒pcDNA-M5A-6A。经Western-blot与IFA验证真核质粒的体外表达后,免疫6周龄Balb/c小鼠,利用微量中和试验检测免疫后的中和抗体,利用MTT法检测免疫后淋巴细胞的增生情况,并与未改造ORF5基因真核表达质粒pcDNA-5A-6A、弱毒疫苗以及灭活疫苗的免疫效果进行比较。结果表明,pcDNA-M5A-6A不但能够刺激免疫小鼠在较短的时间内产生更高水平的中和抗体,而且可以诱导产生更强烈的T淋巴细胞增殖反应。所构建的共表达PRRSV改造的ORF5基因与ORF6基因的DNA疫苗pcDNA-M5A-6A,能够较好的诱发小鼠产生较高的特异性针对PRRSV的中和抗体和细胞免疫应答,为研究能够更好地防制PRRSV的新型疫苗提供了新的思路。     

猪圆环病毒II型ORF2基因在酵母中的高效分泌表达

为了建立一种简便的检测猪圆环病毒2型(PCV2)的方法,本实验将PCV2 的ORF2 基因片段整合到巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株X 33染色体上,构建了X 33(pPICZa ORF2)重组工程菌。经甲醇诱导后,成功的表达出ORF2基因片段。经过Bradford 蛋白质总含量测定和凝胶薄层扫描结果表明,表达产物占重组工程菌培养上清总蛋白的58%,表达量可达47mg/ L。间接ELISA结果初步表明重组表达产物具有良好的抗原性,能够有效地区分PCV2型病毒标准阳性与阴性血清。     

感染性猪圆环病毒2型基因组DNA的分子克隆

本研究通过PCR扩增出猪圆环病毒2型(PCV—2)的全基因组(1768bp),克隆入pcDNA3载体的EcoR I酶切应点,获得含有PCV-2全基因组的重组质粒,命名为pcDNApcv2。将重组质粒大量扩增后,用EcoR I切出1768bp的PCV—2全基因组,在体外用T4DNA连接酶使其连接环化。用脂质体法将体外连接产物转染无PCV污染的PK—15细胞,经4次连续传代,用间接免疫荧光实验(IFA)及电镜观察证实已获得复制能力的PCV—2病毒。由此可见,本试验构建的环化的PCV—2全基因组DNA具有感染性。     

含HVT部分gB基因马立克氏病病毒的转移载体的构建及表达

根据已发表马立克氏病病毒(MDV)血清Ⅰ型短独特区(US)基因序列,设计一对引物用PCR方法扩增出CVI988/Rispens株的包括部分sorf2和sorf3基因及全部us1和us10基因,并克隆入SK(+)载体中,筛选出阳性载体pBUS10.用PCR的方法在火鸡疱疹病毒(HVT)gB基因主要抗原决定簇的前端及后端分别加上血凝素基因(HA)及终止子TAA,并克隆到pcDNA3 载体中,构建出在CMV启动子和增强子控制下含HA及gB基因主要决定簇的表达盒;将此表达盒克隆入pBUS10载体的us10基因中,构建出一种含HA及gB基因主要决定簇的转移载体pBUS10gB3.转染CHO细胞后,用兔抗鸡IgY进行间接免疫荧光试验,证实该转移质粒载体可有效地表达HVT gB基因.     

一株新城疫病毒新强毒株(NL)的分离鉴定及F基因序列测定

１９９６年５月以来,１我国各地鸡群暴发鸡新城疫,其发病特征是常规疫苗免疫无效。为研究此病毒的特征,对从华东某地分离的新城疫病毒毒株（ＮＬ株）进行了生物学研究。利用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增出ＮＬ株融合蛋白基因（Ｆ基因）全序列,并测序。结果表明,ＮＬ株平均致鸡胚死亡时间最短的,其尿囊液中病毒滴度可达２＾９,表明病毒繁殖速度快。Ｆ基因测序结果表明,ＮＬ株为一强毒株,与现今国外已发表的ＮＤＶ株Ｆ基因同源性在８     

串联表达马立克氏病病毒糖蛋白B主要抗原决定簇基因的重组鸡痘病毒的构建

马立克氏病(Marek's disease,MD)是由马立克氏病病毒(Marek's disease virus,MDV)引起的一种具有高度传染性、淋巴组织增生性疾病,病理上以外周神经、性腺、虹膜、各种脏器和皮肤发生单核细胞浸润为特征[1].MD是世界上最重要的家禽传染病之一,是造成世界养禽业重大经济损失的一个主要原因.20世纪70年代早期MD疫苗的发现才使MD得到控制[2].     

猪α1-干扰素的基因改造与高效原核表达

poIFNα1基因中含有大量的大肠杆菌稀有密码子,为了获得高表达,使用了大肠杆菌的偏爱密码子,人工合成了poIFN|α1成熟蛋白编码基因。在保留编码蛋白序列的同时,使其5′端A+T的含量增加到最大限度,并将其终止密码子改为TAA。将合成的poIFNα1成熟蛋白编码基因插入原核单纯表达载体pRLC中,转化大肠杆菌DH5α。实现了poIFNα1在大肠杆菌中的高效表达,表达产物以包涵体形式存在。纯化的包涵体经含DTT的6 mol/L盐酸胍的变性液溶解及含GSHGSSG的复性液复性处理,复性后的表达产物浓缩后经凝胶层析纯化,细胞病变抑制法测定表明,重组poIFNα1具有较高的抗病毒活性,约为6.4x10⁶u/mg。      

猪圆环病毒2型及猪繁殖与呼吸综合症病毒的快速检测

According to the published genome sequences of Porcine circovirus type 2(PCV2)and Porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV),primers were designed and PCR,RT-PCR were set up for the detection of PCV2 and PRRSV,respectively,With the established methods,38 clinical samples from the respiratory disease pigs were detected for the presence of PCV2 and PRRSV. The results demonstrated that 22 samples were positive for PCV2,27 samples were positive for PRRSV and among the above positive samples,18 samples were positive for both viruses,The data obtained in the present study indicated that PCV2 and PRRSV maybe play an important role in the course of the development of respiratiory diseases.     

湖南宜章发现两栖动物侏树蛙

2016年4月和2017年5月,在湖南省莽山国家级自然保护区相思坑(24°56′57.51″N,112°59′18.21″E,海拔1 342 m)采集到小型蛙类6只,均为雄性成体,经鉴定为无尾目(Anura)树蛙科(Rhacophoridae)树蛙属(Rhacophorus)的侏树蛙(R.minimus),属于湖南省两栖动物分布新记录。测量了6只个体的14项外形特征量度数据,并描述了其形态特征。PCR扩增16S rRNA基因并测序,与同属另外8种的16S rRNA基因进行分子系统进化分析,结果支持形态鉴定结果。目前标本保存于湖南师范大学生命科学学院脊椎动物学实验室。