乳猪肝细胞短期培养后的低温保存

本文对乳猪肝细胞短期培养后冻存法和直接冻存法进行比较。采用改良原位两步胶原酶灌注法分离乳猪肝细胞,将肝细胞接种到含10％DMSO、激素、生长因子和10％NBS的RPM1 1640培养基中,用阶段性冻存法保存肝细胞,分别对直接冻存和培养后冻存10天、20天复苏的肝细胞进行培养,动态观察其活率和功能。研究结果表明各组复苏后的肝细胞均保持较高的活率;短期培养后冻存组肝细胞活率、G-6-Pase活性、白蛋白和葡萄糖合成功能及安定转化能力均较直接冻存组为高;LDH活性低于直接冻存组;冻存时间的长短对其白蛋白、尿素和葡萄糖合成功能有一定影响。因此,短期培养后冻存法较直接冻存法为好。     

重组8型腺相关病毒介导HBV急性感染树鼩模型建立

目的利用重组8型腺相关病毒介导1.3拷贝HBV基因组（1.3HBV,ayw亚型）在树鼩肝脏表达,建立HBV急性感染树鼩模型。方法通过大腿内侧静脉注射将携带有1.3 HBV的重组8型腺相关病毒（recombi-nant adeno-associated virus 8,rAAV8-1.3HBV）导入树鼩肝脏,通过ELISA检测树鼩血清中HBsAg、HBeAg、HBsAb、HBeAb、HBcAb,荧光定量PCR检测树鼩肝脏和血清中HBV DNA,全自动生化分析仪检测血清中ALT水平,并观察感染后肝脏的病变情况。结果 HBV感染主要血清标志物1～2周内均检测阳性;30 d后肝组织仍可检测到病毒抗原阳性细胞;55 d时肝组织HBV DNA拷贝数仍可达到104～105;树鼩血清中HBV DNA拷贝数持续一个月高于正常组;肝组织炎细胞略增多,血清ALT水平持续升高。结论 rAAV8所携带的HBV基因组高效专一导入树鼩肝细胞并复制表达,成功建立HBV急性感染树鼩模型,为进一步探索rAAV8树鼩慢性感染模型打下一定的基础。     

肝脏缺血预处理对肝细胞分离、冻存效果的影响

大量研究表明,对肝脏进行缺血预处理（ischemic preconditioning,IPC）对肝脏保护有重要意义,IPC能够提高肝脏对缺血再灌注损伤的耐受能力.但IPC对分离后的肝细胞是否具有同样的保护作用,目前尚无报道.本研究旨在明确在对大鼠肝细胞分离以前对大鼠肝脏进行缺血预处理是否可以提高肝细胞分离和冻存的效果.在本研究中,30只SD大鼠,随机分为3组（G1,G2,G3）,在对大鼠肝脏进行分离以前,对G2和G3组大鼠分别进行5和10min的缺血预处理,10min后再进行肝细胞分离,G1组大鼠则不进行特殊处理.分离后,比较各组肝细胞产量及存活率.将所得的肝细胞分别冻存14,28天后进行肝细胞的复苏,对各组肝细胞的存活率、细胞活性（四唑盐比色实验）、冻存液LDH漏出浓度3项指标进行对比分析.研究发现,缺血预处理组的大鼠肝细胞（G2,G3）在肝细胞的活率、MTT实验、冻存液的LDH浓度测定等方面均优于对照组.由此可见,在肝细胞分离之前,对肝脏实施缺血预处理能够明显提高所分离肝细胞的存活率,还可以提高肝细胞短期内的冻存效果.但相对大鼠肝脏进行缺血预处理的时间,5和10min并没有明显的统计学差异.     

原位胶原酶循环灌注法分离猪肝细胞

本文建立了原位胶原酶循环灌注分离猪肝细胞方法并与离体两步胶原酶灌注法进行了比较。猪门静脉和下腔静脉分剐插管,先用D-Hanks液灌注,再采用自制的循环灌流装置进行胶原酶循环原位灌注分离猪肝细胞,分离后的肝细胞以5×105/ml培养,观察分离和培养7d的肝细胞产量、活率、蛋白质合成功能、葡萄糖合成功能和LDH含量。同时测定离体组的上述指标。研究结果表明采用原位胶原酶循环灌注法每克肝组织分离获得的肝细胞总量为5.1×107,肝细胞活率98.6％,培养7d肝细胞活率89.5％。肝细胞的蛋白质合成功能在培养7d中保持稳定;葡萄糖合成功能从1d时1.05±0.15nmol/cell下降到3d时0.74±0.09nmol/cell;LDH含量在3d较高。原位胶原酶循环灌注法分离的猪肝细胞总量、活率高于离体法;蛋白质合成功能和葡萄糖合成功能强于离体法。因此,原位胶原酶循环灌注分离猪肝细胞方法可获得大量高活率和良好功能的猪肝细胞。     

Oct4介导小鼠原代肝细胞直接重编程为Pdx-1阳性细胞

目的：Oct4介导小鼠原代肝细胞直接重编程为Pdx-1阳性细胞的研究。方法：利用小鼠慢病毒载体pWPT-Oct4联合包装质粒包装病毒,含有PEG6000的病毒浓缩液对病毒原液进行浓缩;慢病毒浓缩液感染利用两步胶原酶灌流法分离培养的小鼠肝细胞;RT-PCR检测肝脏、胰腺谱系及多能性转录因子表达。结果：含有Oct4慢病毒感染小鼠原代肝细胞后,Oct4出现表达,肝细胞相关转录因子（Alb、Afp）表达逐渐下降,内胚层早期标志物Foxa2的表达随时间的增加而减弱,Sox17在感染后12d、18d出现表达,并表达胰腺发育过程中的关键性基因-胰十二指肠同源异盒蛋白-1（pancreatic duodenal homeobox-1,Pdx-1）;不表达Nanog及Sox2等多能性基因。结论：在Oct4介导下成功去分化小鼠原代肝细胞,出现Pdx-1阳性细胞。     

HBV转基因小鼠--乙型肝炎研究的重要工具

HBV感染具有严格的种属特异性和组织亲嗜性,所以可用于研究的动物模型很少。随着转基因技术的出现和发展,人们通过研制转基因动物模型来研究病毒致病机理。把HBV的DNA或其片段转入小鼠受精卵建立起来的HBV转基因小鼠,已被广泛地应用于乙型肝炎的研究中,主要体现在以下3个方面：研究HBV的致病机制、与肝细胞癌的关系及寻找、评价治疗乙肝的方法。     

基于双荧光系统的HepG2肝细胞癌原位移植裸鼠模型建立及活体荧光成像动态定量分析

目的:建立一种可以实时、定量、动态监测的肝细胞癌原位移植模型,并利用活体荧光成像系统对裸鼠体内原位肝细胞癌生长进行分析。方法:利用慢病毒包装系统包装pCDH-GFP-Luc质粒,将绿色荧光蛋白(GFP)和萤光素酶(Luc)基因通过病毒感染的方式整合到HepG2肝癌细胞染色体中,利用流式细胞术分选GFP+细胞,扩增培养后,将该细胞注射到裸鼠皮下进行成瘤,成瘤后分离肿瘤组织接种裸鼠肝脏,将造模成功的裸鼠分为对照组和治疗组,分别灌胃给与0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)和50 mg/kg索拉非尼,2/d,连续28 d,每7 d利用活体荧光成像系统观察肝癌细胞在对照组和治疗组裸鼠肝脏内的生长情况。实验结束后,分离裸鼠肝脏肿瘤,拍照称重。结果:建立了稳定表达双荧光的人肝癌细胞系HepG2-GFP-Luc,体外发光强度与表达萤光素酶的细胞数量呈正相关(R2=0.9945);建立了肝细胞癌原位移植活体荧光成像模型,对照组和治疗组肝脏内肿瘤细胞荧光强度随时间的延长逐渐增加,治疗组荧光强度明显低于对照组。定量分析结果显示,在第24、31和38 d,治疗组荧光总光子数值显著低于对照组;治疗组平均瘤重显著低于对照组。结论:建立了一种肝细胞癌原位移植荧光成像模型,可通过活体成像系统对肿瘤大小进行动态定量分析,为抗肝癌药物的药效学评价提供了实时定量分析动物模型。     

树鼩肝细胞体外分离培养体系的复建及主要影响因素分析

树鼩（Tupaia Belangeri）与人和灵长类亲缘关系较为接近,是乙型肝炎研究中备受关注的小动物模型,而其原代肝细胞的分离和培养则是建立HBV体外感染模型及应用和基础研究的关键的第一步,但由于以往的文献报道均较为简要,需要较长时间的摸索。本研究通过与机械分离法的直接比较,验证了两步灌注法在树鼩肝细胞分离中的优越性。进而发现,在分离后的体外培养过程中,二甲基亚砜不仅能够促进和维持原代肝细胞的分化,而且能够显著地抑制纤维状细胞群的出现。同时,肝细胞生长因子（HGF）和表皮生长因子（EGF）能够促进肝细胞在体外长期存活。在此优化的条件下,原代培养可持续4—5周,并且较多的细胞聚集形成类似肝窦结构的形态,从而为乙型肝炎病毒感染机理研究和药物筛选提供了必备的先决条件,也为丙型肝炎病毒和丁型肝炎病毒及单纯疱疹病毒等研究和药物筛选提供了可能。     

重组逆转录病毒的制备、浓缩及保存研究

选择含有新霉素磷酸转移酶Ⅱ(Neo^R)的重组逆转录病毒载体,用包装细胞进行包装,得到了含有重组逆转录病毒粒子的病毒上清,该病毒上清经差速离心法浓缩后,－80℃无任何添加物的情况下保存3个月,体外感染靶细胞NIH3T3以测定其滴度,冻存前后的浓缩病毒上清的感染滴度无明显降低,经过冻存的浓缩病毒上清的感染滴度仍可达到10^6cfu/ml,具有理想的感染靶细胞的能力。     

简易胶原酶灌流法分离培养大鼠肝细胞

目的:对传统的胶原酶灌流法加以改进,以节约分离肝细胞的实验时间和成本。方法:采用离体法,分3次从肝窦灌注含有肝素钠的D-Hanks液共150mL;用30mL终浓度为0.04%的胶原酶液(Ⅰ∶Ⅳ=1∶4)灌洗2min;去除表皮等结缔组织,过筛、离心洗涤即得肝细胞。结果:平均1g大鼠肝脏能获取7×106～8×106个肝细胞,细胞存活率为96.3%。结论:简易胶原酶灌流法的胶原酶用量是Seglen二步灌注法用量的1/16,是半原位的1/4;灌流时间约5min,是Seglen二步灌注法的1/4;半原位法也通常需要6～7min。此法具有装置简单、试剂消耗量小、操作方便快捷、实验成本低的特点,为需要周期性重复建立大鼠肝细胞模型的实验提供了一种简单快速的分离方法。     

血液透析滤过和血液透析联合血液灌流治疗尿毒症伴皮肤瘙痒的疗效

目的：探讨不同透析模式对长期行血液透析（hemodialysis,HD）尿毒症伴皮肤瘙痒患者的治疗效果。方法：采用回顾性方法,选择规律性行HD尿毒症伴皮肤瘙瘁患者46例,根据患者接受治疗的模式分为血液透析滤过组（HDF组）和血液透析联合血液灌流组（HP／HD组）,收集患者皮肤瘙痒、血清甲状旁腺素（PTH）、B2．微球蛋白（p2一MG）等指标资料进行分析。结果：HDF和HP／HD治疗后。患者皮肤瘙痒症状得到有效缓解（P〈0．05）,且HP／HD组缓解率（91-3％）显著高于HDF组（65．2％）;两组血清B2．MG、PTH均下降（P〈0．05）,HP／HD组132-MG清除率（69．0±4．3％）显著高于HDF组（57．1±4．1％）,两组在清除PTH方面无显著差异（P〉0．05）。结论：HP／HD和HDF治疗能很好的清除患者体内B2-MG、PTH等中分子物质,改善顽固性皮肤瘙痒症状效果显著,且HP／HD改善效果更明显。     

籽鹅卵泡颗粒细胞烯醇化酶过表达模型的建立及其对孕酮分泌的影响

目的：建立廿烯醇化酶（EN01）腺病毒过表达载体转染原代培养籽鹅卵泡颗粒细胞模型,探讨EN01过表达对颗粒细胞孕酮分泌的影响。方法：采用EN01腺病毒过表达载体以梯度感染复数值（MOI）100、250、350、400pfu／cell转染原代培养籽鹅卵泡颗粒细胞,于转染后2,4h、48h,荧光倒置显微镜下观察绿色荧光蛋白（GFP）表达。双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（EusA）研究EN01过表达对颗粒细胞孕酮分泌的影响。结果：最佳转染条件是,当MOI为350pfu／cell,转染48h后,转染率达100％;通过荧光定量PCR与Westernblot法,检测到EN01mRNA与蛋白均过表达（P〈0．01）;与培养液组和腺病毒空载体组相比较,EN01过表达使颗粒细胞孕酮分泌量极显著增加（P〈0．01）。结论：EN01过表达会使体外原代培养的籽鹅卵泡颗粒细胞孕酮分泌量增加。     

老年慢性阻塞性肺病患者继发革兰氏阴性杆菌感染的菌型及耐药性分析

目的：探讨老年慢性阻塞性肺疾病（COPD）继发院内革兰氏阴性杆菌感染的发病机理、菌型分布及耐药性。方法：从本院老年COPD继发医院革兰氏阴性杆菌（GNB）肺炎患者痰液中分离的213株GNB进行菌型分类,选用12种常用抗菌药物进行体外MIC药敏试验。结果：213株占COPD继发医院肺炎病原菌总数的69．6％（213／306）。老年COPD患者继发革兰氏阴性菌感染菌种分类为：铜绿假单胞菌（35．7％）、肺炎克雷伯菌（21．1％）、大肠埃希菌（17．4％）、阴沟肠杆菌（11．7％）、嗜麦芽假单胞菌（7．9％）、其他病原菌（6．1％）;药敏结果表明,所有GNB对抗菌药物耐药率均呈上升趋势。结论：铜绿假单胞菌是COPD继发GNB感染的主要致病菌,在临床治疗中必须重视菌型鉴定和药敏试验,合理使用抗生素,才能控制院内感染GNB的发生和日益增高的耐药趋势。     

玻璃化法超低温保存蛇莓茎尖

本文采用玻璃化法对蛇莓离体茎尖超低温保存进行了初步探讨。研究了低温锻炼时间、预培养时间、预处理时间、玻璃化液处理时间和液氮保存时间对超低温保存后成活率的影响。经优化,蛇莓的最高成活率可达（42.00±2.74）%。     

牙鲆胚胎冷冻损伤的观察

为了观察牙鲆胚胎在冷冻保存过程中的形态受损情况,将其浸入20%PM（20%丙二醇和20%甲醇1∶1的混合液）中平衡,并用程序化法和玻璃化法对其冷冻保存2h后解冻,用摄影显微镜记录其在抗冻剂里平衡时和冷冻保存后的形态。结果显示在平衡过程中胚胎卵膜出现凹陷（称为溶液损伤）,但可以恢复;在冷冻过程出现胞内冰损伤,是致命的;用程序化法冷冻保存的尾芽期胚胎卵膜和卵黄完好,胚体边缘受伤;用玻璃化法保存的尾芽期胚胎,卵膜和卵黄损伤较重,胚体损伤较轻;因此将玻璃化法和程序化法结合可以达到扬长避短的效果。     

滇南小耳猪精液的直接冷冻保存

目的建立滇南小耳猪精液冷冻保存方法,加速云南省特有小型猪种的小型化选育。方法利用脉冲电刺激模式诱导公猪输精管自助收缩排精。利用直接冷冻新技术（DFM）研究不同冷冻方案对精子的运动度、精子顶体完整性和体内授精胚胎发育能力的影响。结果在直接冷冻方法中,3%甘油防冻剂的作用下,60 s植冰时间和1.5 mm/s的冷冻降温参数对精子运动度保护良好,精子运动复苏率达到61.7%。但是,3%乙二醇虽然与甘油一样对精子的顶体完整性都有很好的保护作用,对精子运动度保护能力较差。此外,3%甘油、60 s植冰、1.5mm/s冷冻速度的直接冷冻的冻精解冻,移植到超数排卵的母猪子宫颈口实施人工授精,获得卵的受精和胚胎发育潜能尚可。结论玻璃管直接冷冻可以完成滇南小耳猪精子的冷冻保存。     

幽门螺杆菌感染细胞模型的建立及感染相关microRNAs的筛选鉴定

目的：建立稳定的幽门螺杆菌（H.pylori）感染人胃上皮细胞模型;筛选并鉴定H.pylori感染相关microRNAs（miRNAs）的表达,为深入研究感染相关miRNAs的调控作用机制奠定基础。方法：将H.pylori标准株按MOI=100：1感染人胃上皮细胞,通过检测炎性细胞因子及炎症反应关键酶的表达综合评价感染模型;采用博奥公司miRNAs V3.0芯片分析细胞感染前后miRNAs表达谱变化,运用实时定量PCR技术和Northern杂交对表达显著差异的miRNAs进行分析鉴定。结果：H.pylori感染细胞24 h后,细胞分泌促炎细胞因子IL-8显著升高（P〈0.01）;启动炎症反应的关键酶COX-2的表达明显增加。芯片数据显示：H.pylori感染引起超过2倍显著差异表达的miRNAs包括：表达上调的PREDICTED-MIR191、miR-155、miR-92b、miR-30b、miR-146a、miR-16等,和表达降低的miR-181b、miR-324。实时定量PCR和Northern杂交结果显示感染相关miR-155和miR-146a在H.pylori感染细胞模型中表达均显著增加（P〈0.01）。结论：miR-155和miR-146a在感染细胞模型中的表达增加提示二者可能参与H.pylori感染的免疫调控过程。     

尿毒症皮肤瘙痒患者采取腹膜透析与血液透析治疗的效果探究

目的：探究尿毒症皮肤瘙瘁患者采取腹膜透析与血液透析治疗的临床效果,并为该病的临床治疗提供经验积累。方法：选取我院肾内科于2005年1月-2012年12月收治的52例尿毒症皮肤瘙痒患者,利用随机数字表法进行分组,分别设为研究组和对照组。其中对照组实施血液透析治疗,而研究组开展腹膜透析治疗。记录两组在治疗前和治疗后第8周末血生化客观指标及皮肤瘙痒程度,并做好对比。结果：两组在治疗前的皮肤瘙痒评分、β2-MG、PTH、p3,BUN、SCr值差异无统计学意义（P〉0．05）;治疗后,研究组皮肤瘙瘁评分为（3．4±0．8）分,对照组为（5．8±0．9）分,差异有统计学意义（P〈0．05）。治疗后,研究组β2-MG、PTH及Ps．均低于对照组,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论：尿毒症皮肤瘙痒患者的主要致敏因子为大中分子,采取腹膜透析能够有效清除大分子物质,进而达到瘙痒程度的有效改善。     

氧哌嗪青霉素-他唑巴坦钠对尿路感染中阴性杆菌耐体外药敏分析

目的：研究由阴性杆菌致尿路感染患者对氧哌嗪青霉素-他唑巴坦钠耐体外药敏情况。方法：选取并分析2012年1月-2013年1月尿路感染患者尿液培养出的195株致病菌的分布及对氧哌嗪青霉素-他唑巴坦钠的耐药情况。结果：致病菌以革兰阴性杆菌为主共有128例（65.64%）,革兰阳性菌共有59例（30.25%）,致病菌对氧哌嗪青霉素-他唑巴坦钠均有明显的耐药性（P〈0.05）。结论：革兰阴性杆菌是尿路感染的主要致病菌,且对氧哌嗪青霉素-他唑巴坦钠具有较强的耐药性。     

不同术式对雌兔内分泌和骨代谢的影响

目的观察不同子宫、卵巢切除术式对兔术后早期内分泌激素和骨代谢的影响。方法45只健康成年雌兔随机分为5组,Ⅰ组：单纯子宫全切除组;Ⅱ组：子宫全切＋单侧卵巢切除组;Ⅲ组：子宫全切＋双侧卵巢切除组;Ⅳ组：双侧卵巢切除组;Ⅴ组：对照组。测量术前、术后1、2、3个月的体重、雌二醇（E2）、甲状旁腺素（PTH）、血钙、血清碱性磷酸酶（ALK）和骨密度（BD）。结果术后第2、3个月,Ⅲ组、Ⅳ组出现烦躁不安和体重减轻的实验兔要显著高于Ⅰ组和Ⅱ组;术后第2个月,Ⅱ组E2浓度（17．66±6．06）pg／mL,显著降低,术后第3个月,血钙增高（3．86±0．11）mmol／L,第2椎骨骨密度显著降低,与对照组相比（P〈0．05）,有显著差异;Ⅱ组术后第3个月PTH增高,但与对照组相比无显著差异（P〉0．05）。Ⅲ组、Ⅳ组术后第2个月起,E2、PTH、血钙、ALT和BD,与对照组相比均有显著改变。结论子宫切除术会影响雌兔内分泌的变化,只保留单侧卵巢时不能维持相应的正常生理功能。