幽门螺杆菌感染细胞模型的建立及感染相关microRNAs 的筛选鉴定

目的:建立稳定的幽门螺杆菌(H.pylori)感染人胃上皮细胞模型;筛选并鉴定H.pylori感染相关microRNAs(miRNAs)的表达,为深入研究感染相关miRNAs的调控作用机制奠定基础。方法:将H.pylori标准株按MOI=100:1感染人胃上皮细胞,通过检测炎性细胞因子及炎症反应关键酶的表达综合评价感染模型;采用博奥公司miRNAs V3.0芯片分析细胞感染前后miRNAs表达谱变化,运用实时定量PCR技术和Northern杂交对表达显著差异的miRNAs进行分析鉴定。结果:H.pylori感染细胞24 h后,细胞分泌促炎细胞因子IL-8显著升高(P<0.01);启动炎症反应的关键酶COX-2的表达明显增加。芯片数据显示:H.pylori感染引起超过2倍显著差异表达的miRNAs包括:表达上调的PREDICTED-MIR191、miR-155、miR-92b、miR-30b、miR-146a、miR-16等,和表达降低的miR-181b、miR-324。实时定量PCR和Northern杂交结果显示感染相关miR-155和miR-146a在H.pylori感染细胞模型中表达均显著增加(P<0.01)。结论:miR-155和miR-146a在感染细胞模型中的表达增加提示二者可能参与H.pylori感染的免疫调控过程。     

幽门螺杆菌感染诱导microRNA-146a表达的机制研究

目的：探讨幽门螺杆菌（H.pylori）感染引起人胃上皮细胞microRNA-146a（miR-146a）上调的分子机制。方法：分别用H.pylori重组蛋白、全菌蛋白、培养上清、感染相关炎性因子（IL-8、TNF-α、IL-1β）以及TLR配体刺激人胃上皮细胞,检测细胞miR-146a的表达;通过生物信息学软件预测和荧光素酶实验鉴定miR-146a启动子,分析诱导表达的相关信号通路。结果：除H.pylori感染相关炎性因子IL-8、TNF-α、IL-1β能够明显诱导miR-146a表达上调（P〈0.01）外,其他刺激因素均不能诱导miR-146a的显著表达;当采用RNAi技术将IL-8、TNF-α、IL-1β分别沉默,检测H.pylori诱导miR-146a表达时,各沉默组与对照组均无显著差异。软件预测显示miR-146a启动子序列中含有多个NF-κB结合位点;H.pylori能够显著增加miR-146a启动子荧光素酶报告载体的相对荧光素酶值;当启动子序列中的NF-κB结合位点发生突变,其相对荧光素酶比值显著降低（P〈0.05）。结论：H.pylori感染相关炎性因子IL-8、TNF-α、IL-1β能够诱导miR-146a表达明显上调;NF-κB信号通路在H.pylori感染诱导miR-146a的表达中发挥关键作用。     

幽门螺杆菌感染诱导microRNA-146a表达的机制研究

目的:探讨幽门螺杆菌(H.pylori)感染引起人胃上皮细胞microRNA-146a(miR-146a)上调的分子机制。方法:分别用H.pylori重组蛋白、全菌蛋白、培养上清、感染相关炎性因子(IL-8、TNF-α、IL-1β)以及TLR配体刺激人胃上皮细胞,检测细胞miR-146a的表达;通过生物信息学软件预测和荧光素酶实验鉴定miR-146a启动子,分析诱导表达的相关信号通路。结果:除H.pylori感染相关炎性因子IL-8、TNF-α、IL-1β能够明显诱导miR-146a表达上调(P<0.01)外,其他刺激因素均不能诱导miR-146a的显著表达;当采用RNAi技术将IL-8、TNF-α、IL-1β分别沉默,检测H.pylori诱导miR-146a表达时,各沉默组与对照组均无显著差异。软件预测显示miR-146a启动子序列中含有多个NF-κB结合位点;H.pylori能够显著增加miR-146a启动子荧光素酶报告载体的相对荧光素酶值;当启动子序列中的NF-κB结合位点发生突变,其相对荧光素酶比值显著降低(P<0.05)。结论:H.pylori感染相关炎性因子IL-8、TNF-α、IL-1β能够诱导miR-146a表达明显上调;NF-κB信号通路在H.pylori感染诱导miR-146a的表达中发挥关键作用。     

DEC205在幽门螺杆菌感染胃上皮细胞中的表达

目的：探讨幽门螺杆菌及其热休克蛋白60（H．pylori—HSP60）感染与胃上皮细胞表面DEC205受体的关系。方法：分别用H．pylori、H．pylori-HSP60及E．coliLPS刺激胃上皮细胞KATOIII,利用免疫荧光染色技术观察KATOIII细胞表面DEC205蛋白的表达变化,再利用RT—PCR技术,观察细胞中DEC205mRNA对上述抗原刺激后的变化。结果：H．pylori、H．pylori—HSP60及E．coliLPS的刺激明显引起细胞表面DEC205蛋白的表达以及细胞内DEC205mRNA的产生。结论：H．pylori感染与胃上皮细胞表面的胞吞受体DEC205有着密切的关系。     

B3型柯萨奇病毒感染的胰岛β细胞中microRNAs表达的变化及生物学意义

B3型柯萨奇病毒（Coxsackie virus B3,CVB3）感染与1型糖尿病发病及胰岛β细胞损伤有关,但机制并不清楚。病毒性心肌炎的研究证实CVB3通过调控微小RNA(microRNAs,miRNAs)的表达引起心肌细胞损伤。本研究的目的是观察CVB3感染的胰岛β细胞中miRNAs表达的变化及生物学意义,进而初步探究CVB3感染引起胰岛β细胞损伤的分子机制。本研究培养了人胰岛β细胞株,感染CVB3后采用miRNAs芯片及荧光定量PCR检测miRNAs表达的变化;转染miR-阴性对照（NC）或miR-146a-5p后感染CVB3,检测细胞活力、肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）及白介素-1β（IL-1β）的含量、IRAK-1及TRAF-6的表达水平;采用双荧光素酶报告基因实验验证miR-146a-5p靶向IRAK-1及TRAF-6。结果显示：CVB3组中miR-101a-3p、miR-140-5p、miR-146a-5p、miR-146b-5p、miR-340-5p的表达水平均低于对照组且miR-146a-5p表达降低最显著;miR-NC...     

血浆miR-106b、miR-146a表达水平与癫痫患儿脑电图参数、Th17细胞和凋亡分子的相关性分析

摘要 目的：分析血浆miR-106b、miR-146a表达特点及其与脑电图参数、辅助性T细胞17（Th17）和凋亡分子的相关性以及诊断癫痫的价值。方法：选择2018年1月至2020年10月我院收治的癫痫患儿75例作为癫痫组,检测受试者血浆miR-106b、miR-146a表达,外周血Th17细胞占比、血清B细胞淋巴瘤/白血病-1（Bcl-1）、BCL2-Associated X蛋白（Bax）、Survivin、半胱氨酸天冬酰胺酶（Caspase-3）水平和脑电图参数α、β、 δ、θ波功率。分析miR-106b、miR-146a与Th17细胞占比、Bcl-1、Bax、Survivin、Caspase-3以及α、β、 δ、θ波功率的相关性,受试者工作特征（ROC）曲线分析miR-106b、miR-146a诊断癫痫的价值。结果：癫痫组血浆miR-106b、miR-146a表达、Th17细胞占比、Bax、Caspase-3水平高于对照组（P＜0.05）,α波功率、θ波功率、Bcl-1、Survivin水平低于对照组（P＜0.05）。miR-106b、miR-146a表达与Th17细胞占比、Bax、Caspase-3呈正相关（P＜0.05）,与α波功率、θ波功率、Bcl-1、Survivin呈负相关（P＜0.05）。联合miR-106b和miR-146a诊断癫痫的曲线下面积（AUC）为0.975,高于单独miR-106b和miR-146a诊断的0.884、0.835。结论：癫痫患儿血浆miR-146a、miR-106b表达增高,miR-146a、miR-106b高表达与脑电图异常、Th17细胞功能障碍以及神经细胞凋亡有关,miR-146a、miR-106b有望成为癫痫诊断的新生物学标志物。     

幽门螺杆菌相关性胃疾病中miR-551b和miR-124a的表达及意义CSCD

目的 检测miR-551b、miR-124a在慢性浅表性胃炎(CSG)、慢性萎缩性胃炎(CAG)及胃癌(GC)患者胃黏膜组织中表达水平,探讨miR-551b、miR-124a与幽门螺杆菌(H.pylori)感染的关系及在胃癌发生、发展中的作用。方法 选择2018年7月-2019年8月在本院肿瘤科与消化科住院的患者120例,其中CSG患者40例,CAG患者40例,GC患者40例。采用qRT-PCR法检测各研究对象胃黏膜组织中miR-551b、miR-124a表达水平,分析miR-551b、miR-124a水平与H.pylori感染及GC患者临床病理特征的关系。结果 GC组患者胃黏膜组织中miR-551b、miR-124a表达水平低于CSG组、CAG组(P<0.05),CSG、CAG组之间比较,差异无统计学意义(P>0.05);H.pylori阳性感染GC患者胃黏膜组织中miR-551b、miR-124a表达水平低于H.pylori阴性感染患者,差异有统计学意义(P<0.05);中低分化、TNM分期为Ⅲ~Ⅳ、浸润深度为T3-T4、有淋巴结转移的GC患者胃黏膜组织中miR-551b、miR-124a表达量低于高分化、TNM分期为Ⅰ~Ⅱ、浸润深度为T1-T2、无淋巴结转移的GC患者(P<0.05)。miR-551b、miR-124a表达与性别、年龄、肿瘤大小无关(P>0.05)。结论 miR-551b、miR-124a在GC患者胃黏膜组织中低表达,且在H.pylori阳性感染患者中低表达,检测miR-551b、miR-124a表达水平可能在H.pylori感染所致胃黏膜组织癌变过程中具有一定预测作用。     

猪伪狂犬病毒Fa株侵染对PK-15细胞microRNAs表达谱的影响

【目的】分析猪伪狂犬病毒Fa株(PRV-Fa)侵染对猪肾传代细胞PK-15 microRNAs(miRNAs)表达谱的影响。【方法】利用Illumina高通量测序技术,鉴定感染和非感染PRV-Fa的PK-15细胞的miRNAs;筛选并利用实时荧光定量RT-PCR(RT-q PCR)验证差异表达miRNAs;对差异miRNAs进行靶基因预测和Gene ontology(GO)分析。【结果】在感染和未感染PK-15细胞中分别检测到384个和405个miRNAs,其中感染PRV-Fa后差异表达的miRNAs共127个(60个上调,67个下调)。荧光定量结果显示差异miRNAs的表达趋势与高通量测序结果一致。GO分析显示,miRNAs广泛参与信号传导、细胞代谢、免疫反应、基因表达等生物学进程,其中miR-10b、miR-16、miR-18a、miR-19b、miR-20a、miR-145-5p、miR-146a、miR-181a、miR-499-5p等miRNAs与免疫相关。在靶基因调控网络图中,ssc-miR-30a-5p与ssc-miR-30d处于关键位置。研究鉴定出5个新的病毒编码miRNAs,其中PRV-miR-LLT2与PRV-miR-LLT4靶向PRV早期蛋白基因EPO。【结论】伪狂犬病毒Fa株感染对PK-15细胞编码miRNAs有显著影响。     

ERK介导幽门螺杆菌HSP60感染胃上皮细胞的IL-8分泌

目的：探讨幽门螺杆菌热休克蛋白60（H．pylori—HSP60）感染胃上皮细胞后ERK与白介素-8（IL-8）分泌的关系。方法：利用ELISA技术,对活菌（IntactH．pylori）、死菌（Heat—killedH．pylori）及H．pylori—HSP60刺激胃上皮细胞KATOIII的IL_8蛋白分泌水平进行分析,观察IL-8随以上抗原浓度梯度的变化及ERK抑制剂PD98059对其分泌量的影响;利用Westernblot技术,观察KATOⅢ胞中磷酸化ERK随IntactH．pylori、Heat—killedH．pylori及H．pylori—HSP60刺激时间的变化状况。结果：IL-8的分泌随着IntactH．pylori、Heat—killedH．pylori及H．pylori—HSP60刺激浓度的升高而增高;H．pylori刺激KATOⅢ胞1h后ERK开始表达,其中IntactH．pylori在9h时表达达到高峰,Heat·killedH．pylori在24h时达到高峰,而H．pylori-HSP60刺激KATOⅢ胞6h后ERK开始表达,9h时达到高峰;PD98059抑制了H．pylori—HSP60诱导的IL-8的分泌。结论：ERK介导了H．pylori—HSP60感染的胃上皮细胞的IL-8的分泌。     

DEC205在幽门螺杆菌感染胃上皮细胞中的表达

目的:探讨幽门螺杆菌及其热休克蛋白60(H.pylori-HSP60)感染与胃上皮细胞表面DEC205受体的关系。方法:分别用H.pylori、H.pylori-HSP60及E.coli LPS刺激胃上皮细胞KATOⅢ,利用免疫荧光染色技术观察KATOⅢ细胞表面DEC205蛋白的表达变化,再利用RT-PCR技术,观察细胞中DEC205mRNA对上述抗原刺激后的变化。结果:H.pylori、H.pylori-HSP60及E.coli LPS的刺激明显引起细胞表面DEC205蛋白的表达以及细胞内DEC205 mRNA的产生。结论:H.pylori感染与胃上皮细胞表面的胞吞受体DEC205有着密切的关系。     

miR-143在人膀胱癌细胞中的作用及机制

目的：microRNAs（miRNAs）的异常表达与多种疾病密切相关,并有可能用于肿瘤治疗。本研究探讨了miR一143在人膀胱癌细胞中的作用及机制,为膀胱癌的临床诊治提供参考。方法：采用体外培养的T24细胞株为研究对象,按照处理方式分为空白对照组（T24）、阴性对照组（NC）、miRNA-143转染组（miR-143）以及si—COX-2转染组（si—COX-2）。3H—thymidine法和Transwell趋化实验检测T24细胞增殖和迁移能力,免疫印迹法检测COX一2蛋白表达变化。结果：miR-143和si—COX-2转染T24细胞48h-72h后,细胞增值能力较正常T24细胞相比下降36％．49％（P〈0．01）,迁移能力下降81％。免疫印迹结果表明,si—COX-2或miR-143转染的T24细胞内源性COX-．2表达水平显著减少至正常T24细胞表达水平的O．39和0-31倍（P〈0．01）。结论：miR-143可降低膀胱癌T24细胞增值力和侵袭力,并抑制COX．2表达。miR-143可能通过COX-2通路发挥对膀胱癌T24细胞的增殖和侵袭的抑制作用。研究结果更加明确了microRNA在癌症中的功能,提示miR-143可作为膀胱癌的治疗候选药物。本研究为探索肿瘤生物标志物和治疗提供新的启示。     

miRNA Signature of Mouse Helper T Cell Hyper-Proliferation

Helper T cells from a mutant mouse model, LAT Y136F, hyper-proliferate and cause a severe lymphoproliferative disease that kills the mice by six months of age. LAT Y136F mice carry a tyrosine to phenylalanine mutation in the Linker for Activation of T cells (LAT) gene. This mutation leads to a number of changes in T cells that result in altered cytokine production including increased IL-4 production, increased proliferation, and decreased apoptosis. Hyper-proliferation of the mutant T cells contributes to lymphadenopathy, splenomegaly, and multi-organ T cell infiltration. miRNAs are short non-coding RNAs that regulate expression of cohorts of genes. This study investigates which miRNAs are expressed in LAT Y136F T cells and compares these to miRNAs expressed in wild type T cells that are undergoing proliferation in two other settings. The first setting is homeostatic proliferation, which was modeled by adoptive transfer of wild type T cells into T cell-deficient mice. The second setting is proliferation in response to infection, which was modeled by infection of wild type mice with the nematode H. polygyrus. By comparing miRNA expression in these three proliferative states (LAT Y136F hyper-proliferation, homeostatic proliferation and proliferation in response to H. polygyrus infection) to expression in wild type naïve CD4⁺ T cells, we found miRNAs that were highly regulated in all three proliferative states (miR-21 and miR-146a) and some that were more specific to individual settings of proliferation such as those more specific for LAT Y136F lymphoproliferative disease (miR-669f, miR-155 and miR-466a/b). Future experiments that modulate levels of the miRNAs identified in this study may reveal the roles of these miRNAs in T cell proliferation and/or lymphoproliferative disease.     

胃癌中显著下调的miR-433的作用靶点研究

目的为了筛选胃癌中miRNAs的表达标记,验证胃癌相关miRNAs的作用靶点,建立一种新的诊断和治疗胃癌的方法。方法运用基因芯片技术检测3个正常胃组织标本,24个胃癌组织标本,胃癌细胞SGC7901和正常胃黏膜细胞GES-1中328个miRNAs的表达情况。用以上方法检测出在胃癌组织和SGC7901中,miR-433的表达水平显著下调。为了确保结果的准确性,采用实时荧光定量PCR对其进行验证。并用基因克隆和Western印迹方法分析miR-433的作用靶点。结果共有26个miRNAs在胃癌标本（包括24个胃癌组织和SGC7901）中异常表达。其中19个miRNAs下调,7个miRNAs上调。实时荧光定量PCR检测出miR-433在胃癌标本中的表达水平显著下调,该结果和基因芯片检测结果一致。另外,在本实验中发现miR-433与Grb2（growth factor receptor—bound protein 2）的表达呈负相关。结论胃癌相关miRNAs已进行了初步筛选。其中,miR-433可能是胃癌中的标记性miRNAs之一,Grb2是其作用靶点。这为建立新的以miRNAs为基础的诊断和治疗胃癌的方法提供了相关信息。     

Expression of cyclooxygenase-2 and nitrotyrosine in human gastric mucosa before and after Helicobacter pylori eradication

To determine whether cure of Helicobacter pylori infection influences the expression of COX-2 and nitrotyrosine in the distal stomach of humans, biopsy specimens were examined immunohistochemically. H. pylori infection was determined using a rapid urease test, culture and histology. Positive staining of COX-2/nitrotyrosine in the epithelium was expressed as the percentage of stained cells to the total epithelial cells.There was a significant increase in COX-2/nitrotyrosine staining in H. pylori -positive subjects compared with H. pylori -negative subjects. Cure of the infection resulted in a significant decrease in both COX-2/nitrotyrosine staining in all patients (52.1+/-12.1% vs 15. 4+/-7.2%, P<0.001; and 57.3+/-13.6% vs 36.1+/-18.0%, P<0.01, respectively). However, immunoreactivity of COX-2/nitrotyrosine was observed in all cases with intestinal metaplasia even after the cure of H. pylori infection.Thus, cure of H. pylori infection may decrease the risk of gastric carcinogenesis due to COX-2 and NO-related compounds in gastric mucosa but not in those patients with intestinal metaplasia.