短发夹RNA慢病毒载体稳定抑制NLRP3表达的HepG2细胞的构建

目的:构建针对NLRP3基因的短发夹RNA(sh RNA)慢病毒表达载体,在Hep G2细胞中鉴定该载体对NLRP3的抑制效果。方法:设计针对NLRP3基因的sh RNA序列,将其插入慢病毒表达载体p WPT-U6-sh RNA-CMV-GFP中,将载体与包装质粒ps PAX2、p MD2.G共转染293T细胞,进行病毒包装;得到的病毒原液浓缩后系列稀释为9个浓度递减的病毒液,分别转染293T细胞后进行滴度测定;用获得的慢病毒液感染人肝癌细胞系Hep G2,获得稳定沉默NLRP3的细胞株;利用实时定量PCR和Western印迹检测稳定细胞株中NLRP3的沉默效应。结果:构建了具有沉默效应的慢病毒干扰载体;稀释法测定干扰病毒滴度为2×108TU/m L;实时定量PCR和Western印迹实验均证实慢病毒转染后,细胞株中NLRP3表达水平明显降低。结论:构建了人NLRP3基因特异性慢病毒干扰载体,获得NLRP3基因稳定干扰的Hep G2细胞株。     

大肠杆菌-双歧杆菌穿梭表达载体的构建及内皮抑素基因的表达

目的:构建大肠杆菌-长双歧杆菌穿梭表达载体,并通过此载体使人内皮抑素基因在大肠杆菌和长双歧杆菌中得到表达。方法:以质粒pDG7、pBCSK( )、pET-9C为基础,构建大肠杆菌-长双歧杆菌穿梭表达载体pET-1128,并将人内皮抑素基因插入到新构建的表达载体中,分别转化大肠杆菌BL21(DE3)和长双歧杆菌NQ-1501。诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和WesternBlot鉴定。结果:成功构建了大肠杆菌-双歧杆菌穿梭载体,人内皮抑素基因在大肠杆菌和长双歧杆菌中均可表达。结论:构建的穿梭载体为今后用双歧杆菌作为生理菌载体进行肿瘤的基因治疗奠定了基础。     

SOX9的表达在诱导肝细胞向胰腺干祖样细胞转化中的意义研究

目的:研究SOX9的表达在诱导肝细胞向胰腺干祖样细胞转化过程中的意义.方法:分离培养小鼠原代肝细胞,包装、浓缩表达OCT4的慢病毒并感染肝细胞,使用RT-PCR监测慢病毒感染后肝细胞中SOX9的表达,并根据SOX9表达情况尝试向胰腺干祖样细胞诱导.使用PCR和免疫荧光鉴定生成的胰腺干祖样细胞.结果:肝细胞感染OCT4-慢病毒后,肝细胞内颗粒逐渐释出,细胞折光性增强.SOX9表达从第6d持续至第8d.从SOX9阴性的第4d开始向胰腺诱导,无集落样的胰腺干祖样细胞生成,RT-PCR检测其标志物CK19为阴性;从SOX9阳性的第6d开始向胰腺诱导,可见集落样生长的胰腺干祖样细胞,RT-PCR检测CK19为阳性,免疫荧光染色显示CK19表达在胞浆中.结论:肝细胞向胰腺干祖样细胞转化过程中SOX9的表达提示了“兼性肝细胞”的出现,此细胞具有向胰腺谱系诱导分化的潜能,这为进一步生成有功能的胰岛内分泌细胞和实现糖尿病的细胞替代治疗提供了理论和实验依据.     

LRP16短发夹RNA慢病毒载体的构建及LRP16稳定抑制细胞的建立简

目的：构建靶向LRPl6基因的短发夹RNA（shRNA）慢病毒表达载体,鉴定其在HeLa细胞中对LRP16的抑制效果。方法：构建pWPT-U6-LRPl6shRNA-CMV-GFP慢病毒载体,通过病毒感染、细胞筛选、Western印迹等步骤,获得LRP16基因稳定抑制的细胞株。结果：构建了具有LRP16干扰效果的慢病毒载体,感染HeLa细胞后获得了稳定沉默LRP16及对照的细胞株;经克隆筛选,在荧光显微镜下观察到近似100％感染细胞发出绿色荧光;Western印迹证实pWPT-U6-L374-CMV-GFP和pWPT-U6-L668-CMV-GFP均可显著抑制HeLa细胞株中LRP16蛋白的表达,其中pWPT-Gsi-L374-GFP的抑制效果更好。结论：构建了靶向人LRP16基因shRNA慢病毒载体及LRP16稳定抑制的HeLa细胞系。     

Oct4介导小鼠原代肝细胞直接重编程为Pdx-1阳性细胞

目的：Oct4介导小鼠原代肝细胞直接重编程为Pdx-1阳性细胞的研究。方法：利用小鼠慢病毒载体pWPT-Oct4联合包装质粒包装病毒,含有PEG6000的病毒浓缩液对病毒原液进行浓缩;慢病毒浓缩液感染利用两步胶原酶灌流法分离培养的小鼠肝细胞;RT-PCR检测肝脏、胰腺谱系及多能性转录因子表达。结果：含有Oct4慢病毒感染小鼠原代肝细胞后,Oct4出现表达,肝细胞相关转录因子（Alb、Afp）表达逐渐下降,内胚层早期标志物Foxa2的表达随时间的增加而减弱,Sox17在感染后12d、18d出现表达,并表达胰腺发育过程中的关键性基因-胰十二指肠同源异盒蛋白-1（pancreatic duodenal homeobox-1,Pdx-1）;不表达Nanog及Sox2等多能性基因。结论：在Oct4介导下成功去分化小鼠原代肝细胞,出现Pdx-1阳性细胞。     

乙型肝炎病毒蛋白和绿色荧光蛋白的共表达研究

目的：构建增强型绿色荧光蛋白（EGFP）标记的乙型肝炎病毒（HBV）真核表达载体,并研究其在真核细胞和小鼠体内的共表达。方法：以质粒pBR322-HBVadr2．0和pCX-EGFP为基础,构建含有双拷贝HBV全基因组DNA和EGFP基因的真核表达载体pCX-EGFP-HBVadr2．0,分别转染真核细胞和小鼠肝组织,建立体外、体内表达系统,研究GFP和HBV基因的表达。结果：构建了真核表达载体pCX-EGFP-HBVadr2．0,EGFP和HBV病毒蛋白在体内和体外均可表达。结论：构建的pCX-EGFP-HBVadr2．0真核表达载体可以GFP作为HBV存在与否的报告基因,提高了培育检测转基因小鼠的效率,为转基因小鼠的制备及后续研究奠定了基础。