驯化噬菌体提高噬菌体对碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌的杀菌能力

【目的】本研究旨在通过驯化提高噬菌体的裂解能力并降低其宿主菌耐受性产生的速度,从而提高对重要病原菌-碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae, CRKp)的杀菌效果。【方法】以临床CRKp菌株Kp2092为宿主菌,利用双层琼脂平板法从污水中分离噬菌体并分析其裂解谱;对其中的广谱强裂解性噬菌体通过透射电镜观察其形态特征并进行全基因组测序;通过噬菌体-宿主连续培养进行噬菌体驯化,并比较驯化前后噬菌体生物学特性的差异。【结果】分离得到的9株肺炎克雷伯菌噬菌体中,噬菌体P55anc裂解能力强且裂解谱广,透射电镜观察发现其为短尾噬菌体。P55anc基因组全长40 301 bp,包含51个编码序列,其中27个具有已知功能,主要涉及核酸代谢、噬菌体结构蛋白、DNA包装和细胞裂解等。噬菌体P55anc经9 d的驯化后,得到3株驯化噬菌体。驯化后噬菌体杀菌能力增强,主要表现为细菌生长曲线显著下降、噬菌体暴发量增多、裂解谱扩大,且宿主菌对其产生抗性的概率显著降低。与此同时,驯化后的噬菌体在热处理、紫外暴露以及血清等环境下保持较好的稳定性。【结论】利用噬菌体-宿主连续培养的方法可对噬菌体进行驯化和筛选,驯化后的噬菌体杀菌效果更强,且在不同压力处理下的稳定性良好,而细菌产生噬菌体抗性的概率也降低。     

霍山石斛产业化发展的问题与对策

介绍了霍山石斛的概况,阐述了霍山石斛产业化发展的重要性和可行性。在分析了霍山石斛资源状况的基础上,着重剖析了霍山石斛产业化发展面临的主要问题,提出了相应的对策措施,旨在为霍山石斛的产业化开发与持续利用提供依据。     

道地药材霍山石斛及其相似种的分子鉴定

为检测霍山石斛与霍山产铜皮石斛、霍山产铁皮石斛及其它产地的几种药用石斛的差异,对霍山石斛及其相似种进行ISSR分子标记比较研究。结果表明,尽管霍山石斛及其相似种的外部形态差异较小,但在ISSR分子标记指纹图谱上却存在着显著而稳定的差异。因此,根据ISSR分子标记指纹图谱所显示的多态性位点差异,能准确鉴别霍山石斛及其相似种植物及药材。此方法简单、稳定性高、可重复性好,在霍山石斛的分子鉴定研究中有较大的应用价值。     

大肠杆菌磷酸甘油酸脱氢酶突变体的构建及抗反馈抑制效应

磷酸甘油酸脱氢酶(D-3-phosphoglycerate dehydrogenase,PGDH,EC 1.1.1.95)为L-丝氨酸合成途径的关键酶,其编码基因为ser A,其活性受到合成产物L-丝氨酸的反馈抑制调控。为解除丝氨酸的反馈抑制,采用定点突变技术把编码PGDH酶344位组氨酸或346位天冬氨酸或364位天冬氨酸的密码子定点突变为丙氨酸密码子。改造后的ser AFbr被连到表达载体pT7-7上,并转入大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中进行表达,破壁回收粗酶液,通过DEAE阴离子柱纯化PGDH突变体,并对其酶活性和IC_(50)值进行了测定。结果,野生型PGDH酶IC_(50)值为7μmol/L,而PGDH双突变体N346A/H344A催化活性与野生型相近,在丝氨酸浓度为160 mmol/L时,其酶活仍保持未添加丝氨酸时酶活的96%,基本解除反馈抑制。     

畜禽粪便好氧堆肥过程氧化亚氮排放机制

好氧堆肥是实现畜禽粪便处理及资源化的有效途径,但畜禽粪便好氧堆肥过程是全球温室气体N2O的潜在来源,与全球温室效应和大气臭氧空洞等问题密切相关.随着畜禽养殖规模的扩大和畜禽粪便堆肥产量的急剧提升,畜禽粪便好氧堆肥过程N2O排放问题日趋严重,堆肥过程N2O排放机制机理研究引发学者们的关注.本文综述了畜禽粪便好氧堆肥过程中N2O的产生途径、排放规律、排放影响因素及其相关微生物学机理研究动态,总结了该过程中减排N2O的措施,并对该领域的研究趋势进行了展望.     

Ⅱ型葡萄糖异构酶N端随机卷曲序列的嫁接效应

木糖/葡萄糖异构酶（xylose/glucose isomerase, XIase/GIase）是果葡糖浆生产的关键用酶,也是重要的模式酶,其组成域的结构和功能一直是研究的热点。本研究采用重叠PCR技术将源自超嗜热菌Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus的Ⅱ型葡萄糖异构酶（TTGIase）N端31个氨基酸序列融合到嗜热菌Thermobifida fusca的I型葡萄糖异构酶（TFGIase）的N端,构建了融合蛋白N-TFGIase。发酵实验结果显示,在相同培养和诱导条件下,N-TFGIase菌体单位浓度产酶量比TFGIase高出约40%;酶学检测结果显示,N-TFGIase比酶活较TFGIase高出26%,最适温度较TFGIase高出5℃,75℃下的半衰期较TFGIase延长30%,最适pH较TFGIase降低1.0。序列分析表明,TTGIase N端序列的mRNA二级结构不形成有阻碍的颈环结构,提高了融合蛋白的表达效率;其含有的31个氨基酸残基的疏水性指数均小于0,利于融合蛋白的初始折叠和包装;其含有的酸性氨基酸残基比例约为碱性氨基酸残基比例的两倍,减小了酸性介质环境对融合蛋白分子表面的影响。实验结果提示,将来自超嗜热菌的Ⅱ型XIase/GIase的N端随机卷曲序列融合到I型XIase/GIase N端,能够提高后者的热稳定性、酸稳定性和表达效率等酶学性质,与我们的预测结果相一致,这为酶的分子改造和生产应用提供了参考。     

葡萄糖异构酶的结构特征及其工业（高产）用酶发掘

葡萄糖异构酶（glucose isomerase,GIase;EC 5.3.1.18）是利用淀粉生产果葡糖浆的关键用酶。筛选和构建适合大规模工业生产的 GIase 一直是研究的热点。本文首先综述葡萄异构酶的基本性质与序列结构和功能特性,在分析比对高生产性能GIase的序列特征和空间结构特征的基础上,发现位于该组GIase 的“催化口袋”上存在12个特有保守氨基酸残基位点,且有5个位点的残基含两性（亲水和疏水）的环状结构。由此提出了“高性能葡萄异构酶存在特有保守位点”的推断假设,并在结合自身实验结果和他人的研究,对基于特有保守位点发掘高生产性能GIase的可行性进行了进一步验证和探讨。该研究思路对高性能商业化GIase的发掘及对其它GIase的性能改造具有重要的参考价值。     

氧哌嗪青霉素-他唑巴坦钠对尿路感染中阴性杆菌耐体外药敏分析

目的：研究由阴性杆菌致尿路感染患者对氧哌嗪青霉素-他唑巴坦钠耐体外药敏情况。方法：选取并分析2012年1月-2013年1月尿路感染患者尿液培养出的195株致病菌的分布及对氧哌嗪青霉素-他唑巴坦钠的耐药情况。结果：致病菌以革兰阴性杆菌为主共有128例（65.64%）,革兰阳性菌共有59例（30.25%）,致病菌对氧哌嗪青霉素-他唑巴坦钠均有明显的耐药性（P〈0.05）。结论：革兰阴性杆菌是尿路感染的主要致病菌,且对氧哌嗪青霉素-他唑巴坦钠具有较强的耐药性。     

转基因猪外源生长激素基因的定位研究——非同位素标记染色体原位杂交技术

近几年来发展起来的染色体原位杂交技术是进行基因定位研究的重要手段。它为进一步进行基因定点整合研究提供依据。本文采用非同位素标记染色体原位杂交技术对经显微注射得到的转基因猪进行了内源和外源猪生长激素(PGH)基因在染色体上定位的研究。 用BhlI对pSMTPGH注射基因(本室制备)进行单酶切,选取3.5kb片段以Dig进行标记。为了提高灵敏度,我们采用了胶体金标记抗体技术并结合使用银增加试剂。利用染色体的组型分析,对杂交点的分布进行了统计学分析,发现内源PGH基因位于12p~(11),与国外Thomsen,P.D.等报道的一致。插入的外源PGH基因呈随机分布,但对某一转基因猪来说,外源基因的插入是集中在某一染色体上。这一结果的发现为进行转基因猪外源基因定点整合提供了依据,也为研究外源基因整合位点和转基因猪表观性状的关系准备了条件。