多药耐药基因分型芯片的制备及优化

目的:建立多药耐药基因(mdr1)分型芯片,以检测患者的单核苷酸多态性(SNPs)。方法:设计并合成探针和引物,制备芯片;构建野生型和突变型质粒,以其为模板经PCR仪扩增后,与芯片上的探针杂交,并用扫描仪分析结果。结果:构建了野生型和突变型质粒,与芯片杂交能很好地区分基因型;优化了制备条件,建立了分型标准。结论:该基因芯片是一种快速特异的基因分型方法。     

经体外缺失诱变组建人杂交干扰素αA/γ

使用寡核苷酸指导的定点突变方法,将人αA型干扰素的完整基因与γ干扰素C端16个氨基酸的编码序列融合,在噬菌体λP_L启动子控制下,合成了一个杂交蛋白质。此蛋白质经抗人α干扰素单克隆抗体纯化后,在MDBK细胞上具有抗病毒活性,并像γ干扰素一样,可被依赖于cAMP的蛋白激酶磷酸化。[γ-~(32)P]杂交蛋白与MDBK细胞的结合,可被αA型干扰素大大抑制(70％)。     

寡核苷酸DNA Microarray用于HLA DRB1基因分型的研究

对寡核苷酸DNA Microarray用于HLA DRB1基因分型的技术进行研究。常规的酚/氯仿法提取标准血样基因组DNA,在DRB1的exon2区域设计一对引物,经PCR扩增基因组相应区段并用Cy5-dCTP进行标记。设计寡核苷酸分型探针,将探针固定在APS-PDC法制作的DNA Microarray上,用标记的PCR产物与之杂交,扫描仪对杂交效果进行扫描,Imagene软件对杂交图像进行分析。共检测了33例标准血样的HLA DRB1基因型。检测结果证明研制的DNA Microarray准确、灵敏。DNA Microarray技术可以有效地检测DRB1等位基因,对比常规的PCR-SSP和PCR-SSO方法、分型基因芯片方法更为直观,并有集成化优势。     

戊型肝炎病毒通用性PCR引物的设计及其基因分型的研究

针对戊型肝炎病毒(HEV)基因分型尚无统一标准的现状,本研究通过分析GenBank中现有的82株HEV基因组全序列,设计一组HEV通用性PCR引物(HEVuPrimer)用于扩增不同基因型HEV可测序长片段,分别基于全基因序列、HEVuPrimer扩增序列和较常用的MXJ引物扩增序列对82株HEV进行基因分型,再以HEVuPrimer扩增1～4型HEV参考株和HEVIg M抗体阳性的临床标本,进行HEV基因分型的研究。研究结果表明HE-VuPrimer扩增区段与全基因序列对82株HEV的基因分型结果完全一致;HEVuPrimer与HEV序列的匹配程度明显高于MXJ引物,且HEVuPrimer区段的基因分型结果较MXJ区段的更为准确。HEVuPrimer可同时扩增出不同基因型HEV基因片段。124份临床标本中,60份测出特异性HEV RNA,阳性率为48.4%,基因分型结果均为4型HEV,但分属于4个不同的基因亚型,核苷酸同源性为80.0%～99.9%,其中有6例近期分离的HEV毒株形成一新的基因亚型。因此,基于HEVuPrimer扩增区段的HEV基因分型方法具有较高的可靠性和可信度,为建立统一、可行的HEV基...     

中风易感性与候选基因SNP位点关联研究

脑中风是严重危害我国中老年人身体健康的主要疾病之一,对中风相关基因单核苷酸多态性位点在人群中分布情况的研究将有助于深入认识中风发病机制及提高防治能力。该研究用寡核苷酸芯片方法检测了8个多态性位点与中风易感性之间的关联。结果发现:寡核苷酸芯片技术作为一种很好的基因分型方法,具有高通量、平行性、微量化、自动化和快速灵敏等的特点,适用于大规模基因分型平台的建立;实验初步发现与中风易感性相关的有血管紧张素原(AGT)基因M235T(OR=3.437,CI=1.211,9.709),载脂蛋白E(APOE)基因cys158arg (OR=9.434,1.686-83.3),亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因C677T(OR=2.591,1.002-6.711),血管紧张素ⅡⅠ型受体(AT1R)基因A1166C(OR=0.213,0.057-0.799)。     

生物素标记寡核苷酸探针探测扩增的病理性突变珠蛋白基因

用末端转移酶催化生物素核苷酸底物(Biotin-ll-dUTP)共价连接在合成的寡核苷酸3’羟基末端,从而合成了两种寡核苷酸探针(β~T_(41-42)及β~A_(41-42))。用它们分别与克隆化扩增的正常和突变的β—珠蛋白基因片段杂变。结果表明该探针都具有与~(32)P探针相似的特异性,其杂交的灵敏度为2—3pg(特异序列)。进而将探测HbS基因的正常和异常两种寡核苷酸19聚体(β~A_6和β~S_6)用~(32)P和生物素分别标记;将HbS杂合子病人的白细胞DNA经聚合酶链反应(PCR)法扩增,并以含正常β—珠蛋白基因的DNA片段作对照,与两种探针分别进行斑点杂交。所得结果完全一致;Hbs杂合子DNA对正常和异常探针都显出杂交信号,而正常DNA只与β~A探针显杂交信号。     

嗜热栖热菌α-葡萄糖苷酶基因的表达及酶学性质研究

用PCR方法从嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)HB27中扩增出编码α-葡萄糖苷酶基因hbg,将其克隆到大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体pET28a( )上,电击转化E.coliBL21(DE3),获得高效表达hbg基因的大肠杆菌重组菌。重组菌经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测表达蛋白相对分子质量约为59kD,与预期分子量相符。经镍柱和阴离子交换柱纯化的重组表达的α-葡萄糖苷酶HBG最适温度为95℃,最适pH值为5.0。     

人三叶因子1大肠杆菌及毕赤酵母表达载体的构建与鉴定

目的:构建人三叶因子1(hTFF1)的大肠杆菌及毕赤酵母表达载体。方法:从人胃窦部提取总RNA,经RT-PCR得到hTFF1 cDNA,用PCR方法扩增hTFF1基因,并将其分别克隆到大肠杆菌的表达载体pET32α及毕赤酵母的表达载体pCAPZαA中,构建原核及真核重组表达质粒pET32α-hTFF1和pGAPZαA-hTFF1。结果:通过双酶切和基因序列分析确定插入pET32α和pGAPZαA中的片段为hTFF1基因片段。结论:重组质粒pET32α-hTFF1和pGAPZαA-hTFF1成功构建,为在比较原核和真核细胞中hTFF1高效表达的情况及下一步的功能研究奠定了基础。     

虹鳟肿瘤坏死因子(TNFα)基因体外表达与纯化的研究

将虹鳟两种肿瘤坏死因子TNFα和TNFα2基因的成熟肽编码区域,用带有BamHI和HindⅢ酶切位点的基因特异性引物进行：PCR扩增。扩增片段用限制性内切酶消化并连接到pQE30表达载体上,连接产物转化到大肠杆菌JM109感受态细菌中。转化子经PCR筛选,质粒测序,完成了虹鳟两种TNFα基因重组子的构建。重组子经体外培养和诱导后,获得了高效表达的TNFα重组蛋白。高效表达的重组TNFα不受诱导剂IPTG的影响,并且由于重组子高效表达而形成了包涵体;重组蛋白产量约占菌体蛋白总量的25％—30％。应用Ni-NTA和固定金属亲和层析(IM-PC)技术,在变性条件下获得了高度纯化的重组蛋白,纯化重组蛋白的产量约为0．5—1mg／L。     

幽门螺杆菌PFGE基因分型方法的研究进展

幽门螺杆菌是引起人类消化性溃疡、胃腺癌和黏膜相关淋巴组织淋巴瘤等的主要原因,在世界各地人群中感染率高达50%以上。关于幽门螺杆菌感染还有很多问题没有解决,其中包括幽门螺杆菌定植和传播机制。幽门螺杆菌可以定植在人胃肠的不同部位,是否存在多克隆定植还不明确。幽门螺杆菌感染是人与人之间的传播,传播途径可能是通过口-口、粪-口或胃-口,传播方式可能以家庭内传播为主,其具体传播途径和方式尚无定论。幽门螺杆菌基因分型技术对定植类型和传播方式的研究有重要意义。幽门螺杆菌基因分型有多种技术,包括随机扩增多态性DNA技术(RAPD),扩增片段长度多态性分析(AFLP),多位点测序分型(MLST)等,这些技术可能都不是幽门螺杆菌基因分型的合适方法。本文分析了幽门螺杆菌基因分型方法现状,重点阐述了幽门螺杆菌脉冲场凝胶电泳(PFGE)基因分型技术应用进展,探讨其揭示幽门螺杆菌定植和传播之谜的可能。     

利用rpoB基因芯片技术进行快速分枝杆菌菌种鉴定

利用rpoB基因芯片技术快速进行分枝杆菌菌种鉴定。以分枝杆菌rpoB基因编码序列为靶基因, 用基因芯片技术检测21种分枝杆菌标准株;8种其它细菌标准株;126株临床分离株。分枝杆菌与其它细菌标准株经PCR扩增后, 分枝杆菌标准株均扩增出360 bp DNA片段, 在其它细菌中, 除甲型溶血性链球菌和假白喉棒状杆菌出现同样片段外, 其它细菌均未见扩增。21种寡核苷酸探针除海分枝杆菌与偶然分枝杆菌的探针有交叉杂交外, 其余均为特异性杂交。对126株临床分离株进行鉴定, 89株为结核分枝杆菌, 占70.6％(89/126), 非结核分枝杆菌(NTM)占9.2％(9/98)。应用rpoB基因芯片技术鉴定分枝杆菌菌种, 是一种快速、准确的方法, 具有较高的临床应用价值。     

人钙调素在大肠杆菌中的表达、纯化及其活性研究

利用基因重组技术,将经PCR扩增获得的人钙调素基因(hCaMcDNA)插入质粒pBV220,构建重组表达载体hCaM/pBV220,用酶切、DNA测序、PCR扩增鉴定阳性克隆.阳性重组子在大肠杆菌DH5α中经温度诱导可高效表达CaM蛋白,经15%SDS-PAGE分析,可观察到一与CaM分子量相符(约17kD)的诱导表达条带,其表达量占菌体蛋白总量20%,并主要以可溶性形式表达.Westernblot结果证实,17kD的表达条带可与标准鼠抗人CaM单克隆抗体起特异反应.用Pheny1-SepharoseCL-4B疏水亲和层析法纯化重组菌超声上清表达产物,每1L菌液可获CaM纯品3～4mg.重组人CaM(rhCaM)与牛脑CaM的氨基酸组成基本一致.生物活性测定结果提示,rhCaM具有激活NAD激酶的活性,其激活程度与标准人脑CaM几乎一致.     

抗HER2人源化单克隆抗体在乳酸克鲁维酵母中的高效表达及其产物分析

目的：在乳酸克鲁维酵母中实现抗HER2人源化单克隆抗体的表达。方法：应用PCR扩增抗HER2人源化单克隆抗体的轻、重链基因,将扩增产物分别克隆入酵母表达载体pYES 2/ochI和pPICZαA/ura3,经限制性内切酶以及DNA序列测定分析插入片段正确后,将重组质粒转化乳酸克鲁维酵母(Δura3)。转化子用半乳糖诱导,经间接ELISA和Western blot鉴定所表达产物的产量以及和抗原结合的活性。结果：构建了抗HER2人源化单克隆抗体轻、重链表达载体pYES 2/ochI+αL和pPICZαA/ura3+αH,摇瓶培养表达产量可达(120±20)mg/L;经还原和非还原SDS-PAGE分析,抗体的轻、重链能够通过分子间二硫键正确装配;所表达抗体可与HER2胞外域特异性结合。结论：实现抗HER2人源化单克隆抗体在乳酸克鲁维酵母中的表达,具有与其抗原特异性结合的能力。     

单根毛发具有不同的DNA分型

在DNA水平上研究遗传变异性已在基因定位和疾病诊断方面取得明显进展,并应用于法医学领域。用限制性片段长度多态性(RFLP)分析DNA时,多个位点分型需要微克量的DNA,单个位点则需数百毫微克量的DNA。象单根毛发和血斑等法医样品往往不能获得上述量的DNA。既然单个DNA分子的某一特定基因片段也能用聚合酶链反应(PCR)大量扩增,为了检测人单根毛发中的多态性DNA顺序,实验以PCR扩增毛发DNA,然后进行DNA分型。     

用聚合酶链反应-指纹图法分析HLA-DRB基因型

将不同个体的DNA经聚合酶链反应(PCR)扩增其HLA-DRB基因的高度多态区域,扩增产物经12％的聚丙烯酰胺凝胶电泳,照像后分析不同个体的指纹图型。PCR-指纹图法(PCR-Fingerprinting)为一种简便,快速的基因分析方法,可加速无关骨髓供者的筛选,它在器官移植及法医的个体识别中有一定实用价值。     

人α-心钠素全基因的化学合成

用固相亚磷酰胺法(solid-phase phosphoramidite method)合成了人α-心钠素(简称α-hANP)的全基因。合成的α-hANP基因全长为96bp,包括编码α-hANP的结构基因、基因5＇端的谷氨酸(作为表达产物用内肽酶Glu-C专一裂解的位点)密码子GAA、基因3＇端的终止信号TGA及基因两端的接头部分。基因分7个寡聚核苷酸片段在DNA合成仪上合成,然后一次性酶促连接成为完整的α—hANP双链基因。化学合成的基因克隆到M13载体上,经分子杂交鉴定筛选出的α-hANP基因克隆株,用双脱氧链终止法进行序列分析,证明核苷酸顺序正确。     

应用逆转录酶链反应对我国流行性出血热病毒分型

针对我国流行性出血热病毒的S片段核蛋白 (NP)编码基因保守核苷酸序列 ,合成了一对引物 ,扩增出编码核蛋白的 5 90bp碱基。扩增的II型产物存在限制性内切酶PstI的酶切位点 ,而I型产物不存在。因此 ,用酶切扩增产物的方法达到病毒分型的目的。试验提取 8份鼠脑传代毒种 ,1份细胞培养物和 2 5份病人血清中的出血热病毒RNA ,同时做 6份正常人血清对照 ,经逆转录PCR酶切分型。试验结果同间接免疫荧光技术 (IFA)分型结果相一致 ,可特异地对我国流行性出血热病毒进行分型。     

胸腺素α原反义寡核苷酸对胃癌细胞生长的影响

目的:探讨反义胸腺素α原(Prothymosin alpha,ProTα)基因转染对胃癌细胞生长的影响,为以ProTα为靶向的胃癌基因治疗开辟新的途径.方法:人工合成ProTα反义寡核苷酸(ProTα-AS-ODN),以阳离子聚合物转染法转染体外培养的人胃癌细胞BGC-823,以正义寡核苷酸和未转染组为对照,应用RT-PCR及免疫细胞化学(immunocytochemistry,ICC)法分析ProTα基因及其蛋白的表达,MTT法分析细胞生长抑制作用,Hoechst 33258检测细胞凋亡.结果:RT-PCR、ICC显示ProTα-AS-ODN转染组ProTα mRNA及其蛋白的表达显著减少,MTT检测表明ProTα-AS-ODN转染组活细胞数较其它各组均低(P＜0.05),Hoechst 33258则显示其凋亡细胞数较其它各纽明显增高(P＜0.01).结论:Proα-AS-ODN成功转染人胃癌细胞BGC-823,封闭了ProTα mRNA的翻译,使已转染的细胞ProTα蛋白的表达减少,且可抑制细胞的增殖并诱导细胞发生凋亡.     

丙型肝炎病毒核心蛋白基因的克隆与表达

以含有丙型肝炎病毒核心蛋白基因的质粒pJLA502-C为模板,用PCR方法重新扩增克隆了核心蛋白基因,在扩增基因的上下端分别增加了NCOⅠ及SalⅠ酶切位点。将克隆的基因酶切后插入表达载体pBV221内,转化大肠肝菌DH_(5α),获得表达非融合核心蛋白的工程菌,42℃热诱导5hr,表达蛋白占菌体蛋白总量的15％。经包涵体纯化及分子筛纯化等,获得核心蛋白,经ELISA及Western Blotting分析表明有较好的抗原性和特异性。     

犬α干扰素基因的高效表达及其活性测定

以伴刀豆球蛋白A(ConA)诱导的犬外周血淋巴细胞中提取的总RNA为模板,通过RT-PCR的方法克隆扩增出犬α干扰素基因,将所扩增基因克隆于原核表达载体pBV220并进行测序,结果显示该基因与GenBank上所公布的犬α干扰素基因同源性为100%.将重组表达载体转入宿主菌进行温敏诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析,证明目的蛋白以包涵体的形式存在,大小约为19kDa.将表达产物变性、复性、透析、纯化处理后加入犬肾细胞上,用水泡性口炎病毒攻毒,测出重组的CaIFN-α具有较高的抗病毒作用,生物活性达到5.11×10 6∪/㎎,重组蛋白质的含量约为13㎎/L.