化学法合成生物素标记寡核苷酸探针

 生物素可通过氨烷基磷酰胺基团连接到寡核苷酸5'末端,反应在水溶液中进行,核苷酸的侧链基团不用保护。我们以这种化学法合成了生物素标记的寡核苷酸探针,其显色灵敏度达50pg,杂交灵敏度达0.4fmol,并与酶标生物素寡核苷酸探针进行了比较,也对两种不同显色体系作了比较。     

生物素标记寡核苷酸探针检测B群轮状病毒

用５′端接氨基标记法,用生物素对Ｂ群轮状病毒（ＧＢＲＶ）ＩＤＩＲ株具有群特异性的３片段基因上２３ｂｐ寡核苷酸序列进行标记,经高效薄层层析板（ＨＰＴＬＣ）纯化,制备了Ｂ群轮状病毒生物素寡核苷酸探针,探针显色灵敏度达１０Ｐｇ,与ＧＢＲＶ、ＫＢ６３株基因杂交可检测到１００ｐｇ靶序列,而与Ａ群和Ｃ群轮状病毒及无关基因均不产生杂交信号,该探针可用于Ｂ群轮状病毒的检测、鉴定,以及同群不同毒株间基因相关性研究。     

生物素标记庆大霉素耐药基因探针

采用低熔点琼脂糖挖块法回收源自澳大利亚的pDG0103的2．0kb的BamHI—HindIII片段(携带2”-0-腺苷转移酶[ANT(2”)]基因)和自建的pBY102的4．9kb的Pst1-EcoRI片段。以缺口平移法,用生物素-7-dATP进行标记,制备成探针。通过southern印迹杂交和菌落原位杂交,证明澳源的Gm—DNA探针与美国的探针同源,而与作者构建的Gm-DNA探针不同源。再以菌落原位杂交法,用生物素标记的上述两种探针分别检测1 06株庆大霉素(Gm)耐药的细菌,结果表明这些菌株携带的Gm钝化酶基因的类型不止一种。     

生物素标记核酸探针的分子杂交技术及其应用

核酸分子杂交是基于核酸链间互补碱基对的特异性结合,测定核酸碱基顺序同源性的一种现代技术,是基因工程、分子遗传及医学诊断中常用的方法。该法较常规诊断法灵敏度高、特异性强,目前,已广泛应用于重组DNA的筛选、基因分祈、染色体基因定位及病毒病诊断等方面。     

应用聚合酶链式反应扩增和光敏生物素标记的cDNA探针检测马铃薯纺锤块茎类病毒

以含马铃薯纺锤块茎类病毒(potato spindle tuber viroid,PSTV)RNA的总核酸为模板,加入人工合成的互补DNA引物,用反转录酶合成PSTV cDNA;在聚合酶链式反应系统中,用两个PSTV特异性引物进行cDNA扩增,用以制备光敏生物素标记的PSTV cDNA探针。用此探针进行斑点杂交检测含PSTV的马铃薯核酸提取液和汁液均出现阳性杂交信号,而健康马铃薯的核酸提取液和汁液的结果均为阴性。光敏生物素标记探针检测纯化PSTV的灵敏度可达5pg;检测感染PSTV的马铃薯块茎汁液的可测出最高稀释度为1:400。     

用生物素标记的寡核苷酸探针检测入淋巴组织和淋巴瘤内免疫球蛋白轻链mRNA

本文用生物素标记的κ和λ寡核苷酸探针,在原位杂交的基础上,检测了人淋巴组织,恶性淋巴瘤和浆细胞瘤内轻链 mRNA。结果显示扁桃体和淋巴结内κ和λ轻链 mRNA 主要分布在次级淋巴滤泡的生发中心和浆细胞内,帽状区阴性。初级淋巴滤泡虽然尚无明显生发中心,但也有 mRNA阳性细胞。κ和λ轻链 mRNA 阳性细胞在淋巴组织内混合存在。相反地,淋巴瘤和浆细胞瘤内 mRNA表达则是单一型的。瘤细胞内的 mRNA 含量较多,可能与 mRNA 复制速度增快有关。实践证明经过Formalin 固定和石蜡包埋的组织切片,mRNA 仍被保存,用检测系统四步法能够捕捉到被检 mRNA,而且是特异的。     

荧光标记寡核苷酸探针及其应用

寡核苷酸探针的标记非常重要。近年来 ,用荧光染料对探针进行非放射性标记受到很大重视 ,并取得了迅速发展 ,广泛应用于核酸序列测定、基因检测以及疾病诊断等。以下就寡核苷酸探针的荧光标记及其应用作一简要综述。     

核酸探针与酶免疫反应板定向结合的方法

为了制备一种可供寡核苷酸探针定向结合的酶免疫反应板, 利用部分水解的尼龙包被酶免疫反应板,通过尼龙所含的氨基基团与寡核苷酸探针所含的5′磷酸基团,在水溶性碳二亚胺的催化下,与酶免疫反应板发生5′端特异性定向共价结合, 并对肺炎支原体的PCR扩增产物进行了重复检测,结果重复性好,方法稳定.利用该方法制备的酶免疫反应板可用于核酸探针的临床检测.     

异羟基洋地黄毒甙元(Digoxigenin)标记的RNA探针在丁型肝炎病毒核酸杂交中的应用

应用异羟基洋地黄毒甙元(Digoxigenin)标记的RNA探针,检测了人和黑猩猩血清及肝脏中丁型肝炎病毒核酸,并与~(32)P标记同一探针做了比较。结果表明,异羟基洋地黄毒甙元标记的RNA探针的杂交效果与同位索探针一致(同源cDNA0.2pg),可用于人和动物血清及肝脏标本内HDV核酸的检测。     

PCR和生物素探针对HFRSV的检测和分型的探讨

分析比较肾综合征出血热病毒（ＨＦＲＳＶ）７６／１１８株和Ｒ＿（２２）株的核苷酸序列,根据引物设计原则及检测分型的目的,设计并合成了３对引物。１对引物取于两毒株间的高同源区段,作为共同引物和外引物;另两对引物取于两毒株间的低同源区段,分别作为野鼠型引物、家鼠型引物和内引物。建立了ＤＮＡ聚合酶链反应（ＰＣＲ）和ＮｅｓｔＰＣＲ方法,并用ＮｃｓｔＰＣＲ合成了两种型特异的生物素探针。ＰＣＲ检测７６／１１８、Ａ＿９、陈、Ｒ＿２、Ｒ＿２２５个毒株,用外引物时均扩增出１条约３００ｂｐ的条带;用内引物的野鼠型引物时,除Ｒ＿（２２）株之外,其余４株均扩增出１条约７０ｂｐ的条带。斑点杂交试验证实了ＰＣＲ检测分型的准确性。ＮｅｓｔＰＣＲ和生物素探针斑点杂交试验可以测出１－１０ｂｇ的目的ｃＤＮＡ。     

Antisense PCR: A simple and robust method for performing nested single-tube PCR

To overcome the disadvantages of two-round nested PCR, we developed a simple and robust closed single-tube nested PCR method (antisense PCR). The method uses antisense oligonucleotides that carry a 5′ tag and that can potentially hybridize to the 3′ ends of the outer primers, depending on the annealing temperature. During initial cycles, which are performed at a high annealing temperature, the antisense oligonucleotides do not hybridize and amplification is directed by the outer primers. During later cycles, for which the annealing temperature is decreased, the outer primers hybridize to the antisense oligonucleotides, extend to produce sequences that are mismatched to the amplicon templates, and consequently become inactivated, whereas the inner primers hybridize to the amplicon templates and continue amplification. Antisense quantitative PCR (qPCR) was compared with one-round qPCR for real-time amplification of four PCR targets (BCR, APC, N-RAS, and a rearranged IGH gene). It had equal amplification efficiency but produced much less nonspecific amplification. Antisense PCR enables both endpoint detection and real-time quantification. It can substitute for two-round nested PCRs but may also be applicable to instances of one-round PCR in which nonspecificity is a problem.     

生物素标记贾第虫全基因组DNA探针的制备及其特异性敏感性测定

用生物素标记的贾第虫全基因组ＤＮＡ探针,在斑点杂交试验中显示高度的敏感性和特异性。用它可检出１０ｎｇ贾第虫ＤＡ,１０＾３个贾第虫滋养体或包囊,且不与阴道毛滴虫、溶组织内阿米巴、弓形虫和ＢＡＢＬ／ｃ小鼠肝细胞ＤＮＡ,以及贾第虫患者粪便上清液发生交叉反应。本探针可用于贾第虫病病原体检测和虫株鉴定研究。     

光敏生物素标记法制备HPV DNA探针

本文将PBR322与HPV重组质粒DNA转化大肠杆菌HB101株,经氨苄青霉素—四环素平板筛选转化成功的菌落,将其扩增、提取质粒DNA,纯化后用限制性内切酶酶切,琼脂糖凝胶电泳区分不同大小的限制性内切片段,并用电洗脱法回收7.9Kb的HPV DNA片段。在高能卤素灯光照下标记光敏生物素制备HPV DNA探针,并检测其特异性和敏感性。结果表明:此探针具有较高敏感性,可达2.5pg;并且具有较强的特异性。     

生物素标记DX_(13)探针及一例甲型血友病家系分析

 以Bio-ll-dUTP替代dTTP经二步法缺口平移标记DNA片段制得生物素DX_(13)探针。其碱性磷酸酶ABC体系显色灵敏度为100fg(约5×10~(-18)mol);与5μg染色体DNA进行Southern印迹杂交,可得清晰的单拷贝杂交区带。以此探针对一血友病家系做RFLP分析,确定两成员为甲型血友病基因携带者。与32P探针对比,两种探针的杂交和分析结果完全一致。表明高标记的生物素探针可应用于单拷贝基因分析和基因诊断。