草酸青霉对含钾矿物风化及钾溶出的影响

【目的】探讨含钾硅酸盐矿物在草酸青霉(Penicillium oxalicum)作用下的风化及钾溶出情况。【方法】利用等离子体发射光谱、X-射线能谱、X-射线光电子能谱分析了3种常见含钾硅酸盐矿物(钾长石、白云母和黑云母)在草酸青霉作用后浸出液和矿物表面元素含量的变化;通过X-射线衍射分析矿物晶相结构的变化;采用共聚焦激光扫描显微镜表征了草酸青霉在矿物表面形成的生物膜;测量了培养液中不同碳源与氮源组分对草酸青霉解钾的影响。【结果】草酸青霉对结构稳定的钾长石和白云母风化速率较低,相比而言黑云母容易被风化并释放可溶性钾元素;草酸青霉在矿物表面形成了网状结构的生物膜,有利于微环境的生成及有机酸在其内的富集,促进微环境内钾的释放,强化微生物对矿物的风化作用;草酸青霉对多种碳源及氮源都表现出较好的适用性。【结论】草酸青霉是一种能够促进多种含钾矿物风化和钾溶出的真菌,在堆肥和生物肥料领域具有广泛的应用前景。     

Man5GlcNAc2哺乳动物甘露糖型糖蛋白的毕赤酵母表达系统构建

蛋白的糖基化对蛋白的活性、高级结构及功能都有重要的影响。酵母表达的糖蛋白不同于哺乳动物表达的杂合型或复杂型糖蛋白,而是高甘露糖型或过度甘露糖化糖蛋白。在前期成功敲除毕赤酵母α-1,6-甘露糖转移酶(Och1p)基因、阻断毕赤酵母过度糖基化,获得毕赤酵母过度糖基化缺陷菌株GJK01 (ura3、och1) 的基础上,通过表达不同物种来源的α-1,2-甘露糖苷酶I (MDSI) 的活性区与酵母自身定位信号的融合蛋白,并通过DSA-FACE (基于DNA测序仪的荧光辅助糖电泳) 分析筛选报告蛋白HSA/GM-CSF (人血清白蛋白与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白) 的糖基结构,发现当编码酿酒酵母α-1,2-甘露糖苷酶 (MnsI) 基因的内质网定位信号与带有完整C-端催化区的拟南芥MDSI基因融合表达时,毕赤酵母工程菌株能够合成Man5GlcNAc2哺乳动物甘露糖型糖蛋白。这为在酵母体内合成类似于哺乳动物杂合型或复杂型糖基化修饰的糖蛋白奠定了基础。     

土生空团菌对白云母的风化作用及解钾特性

摘要:【目的】为了提高森林土壤含钾硅酸盐矿物利用率和改善树木钾素营养,探讨外生菌根真菌对白云母矿物的解钾及风化效应。【方法】通过5种外生菌根真菌在贫钾条件下与白云母的相互作用,考察了3种常用培养基对菌株解钾能力的影响;采用解钾效果最高的土生空团菌在Modified Melin-Norkrans(MMN)培养基条件下,进一步研究了21d浸出过程中主要矿质元素的释放量、生物量、剩余葡萄糖量、产生的小分子有机酸种类及含量、菌丝-矿物微环境的改变,利用扫描电子显微镜观测白云母被风化的痕迹。【结果】培养基对不同外生菌根真菌解钾能力的影响各异,其中土生空团菌在MMN培养基条件下解钾能力最强,其解钾量与生物量、剩余葡萄糖量、pH值显著相关。土生空团菌能够分泌有助于菌丝-矿物粘附的胞外多糖以形成菌丝-矿物微环境,并富集有机酸,促进微环境内钾的释放;菌丝不仅能够粘附在白云母表面产生刻蚀作用,还能破坏矿物深入其内部。【结论】外生菌根真菌具有促进白云母风化并释放钾素的能力,这种能力可能与菌丝、有机酸、多糖的协同作用有关。     

假蜜环菌固体发酵及其产物提取工艺的优化研究

在假蜜环菌固体发酵培养基中分别添加稻草、稻糠、花生壳等农副产品进行发酵,并以无添加物的培养基发酵作为对照。实验结果表明,添加了农副产品的培养基,菌丝生长速率及发酵完成后培养基中的多糖、蛋白质含量均比对照样有所提高。此外,还对假蜜环菌发酵多糖的提取工艺进行了探讨,结果显示最适提取条件为：温度85℃,时间3．0h,料液比为1：4,在此条件下,多糖的提取率为4．6％。     

α-1,6-甘露糖转移酶基因敲除的毕赤酵母菌株构建及其用于融合蛋白HSA/GM-CSF 表达的研究

酵母对蛋白的糖基化修饰过程不同于哺乳动物,其特点为产生高甘露糖型糖基且易发生过度糖基化。本研究通过两步基因重组敲除目标基因的方法成功敲除了毕赤酵母中的α-1,6-甘露糖转移酶(och1p)基因,获得了och1敲除的菌株。以此为基础,构建了高效表达人血清白蛋白与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白(HSA/GM-CSF)的工程酵母,与野生型毕赤酵母表达的过度糖基化HSA/GM-CSF不同,och1敲除菌表达的该融合蛋白糖基化程度明显降低,这为该融合蛋白的开发提供了重要基础。och1敲除菌株的构建不仅提供了一个对糖蛋白进行低糖基化修饰的毕赤酵母表达系统,而且为进一步的酵母糖基工程改造提供了基础。     

一种利用DSA-FACE分析寡糖链的方法

目的：优化糖链结构分析方法,满足高通量、高灵敏度和快速分析糖基结构的要求。方法：基于DNA测序仪的荧光糖电泳（DSA-FACE）,将糖蛋白经过糖苷酶酶切获得糖链,并与荧光标记物8-氨基芘基-1,3,6-三磺酸（APTS）进行衍生化反应,标记样品经过Sephadex-G10、HPLC纯化后,用DNA3100测序仪电泳分离,用Genescan3.7软件进行数据分析。结果：利用DSA-FACE技术分析了标准品Man5GlcNAc2和Gal2GlcNAc2Man3GlcNac2,并得到糖蛋白牛核糖核酸酶B的5种N-糖基结构（Man5～9GlcNAc2）。结论：DSA-FACE是分析糖基结构的有效技术手段,能够实现对糖基结构的高通量、高灵敏度和快速分析。     

假蜜环菌液体种子培养条件的优化及其应用研究

目前国内多采用固体菌种进行假蜜环菌的发酵生产。在假蜜环菌液体种子的培养及培养条件优化等方面进行了探讨,优化条件为:玉米淀粉为较适宜碳源;酵母浸出粉为较适宜氮源;添加KH2PO4、吐温-80对菌丝生长有一定的促进作用。正交试验结果显示,适合假蜜环菌菌丝体生长的培养基配方为玉米淀粉30 g/L,酵母浸出粉3g/L,KH2PO41.5 g/L。此外,还探讨了液体种子与传统的固体种子对固体发酵产物的影响,结果表明,接种液体种子能提高固体发酵的主要代谢产物的产量。该实验为改善假蜜环菌现行的生产工艺提供参考。     

抗HER2人源化单克隆抗体在乳酸克鲁维酵母中的高效表达及其产物分析

目的：在乳酸克鲁维酵母中实现抗HER2人源化单克隆抗体的表达。方法：应用PCR扩增抗HER2人源化单克隆抗体的轻、重链基因,将扩增产物分别克隆入酵母表达载体pYES 2/ochI和pPICZαA/ura3,经限制性内切酶以及DNA序列测定分析插入片段正确后,将重组质粒转化乳酸克鲁维酵母(Δura3)。转化子用半乳糖诱导,经间接ELISA和Western blot鉴定所表达产物的产量以及和抗原结合的活性。结果：构建了抗HER2人源化单克隆抗体轻、重链表达载体pYES 2/ochI+αL和pPICZαA/ura3+αH,摇瓶培养表达产量可达(120±20)mg/L;经还原和非还原SDS-PAGE分析,抗体的轻、重链能够通过分子间二硫键正确装配;所表达抗体可与HER2胞外域特异性结合。结论：实现抗HER2人源化单克隆抗体在乳酸克鲁维酵母中的表达,具有与其抗原特异性结合的能力。     

氮锌配施对小麦锌转运、分配与累积的影响

通过田间试验,研究不同氮锌肥运筹方式对小麦植株不同器官中锌的转运、分配与累积的影响。结果表明: 不同处理植株器官中锌浓度和锌累积量的差异达显著水平。与N₃(120 kg·hm^-2)相比,N₁(240 kg·hm^-2)和N₂(180 kg·hm^-2)的籽粒锌浓度分别提高22.0%和8.9%;与未施锌(CK)相比,ZnS(土施锌肥)、ZnF(喷施锌肥)和ZnS+ZnF(土施结合喷施锌肥)处理的籽粒锌浓度分别提高15.4%、60.5%和72.8%,籽粒锌累积量分别提高21.3%、82.5%和102.4%。籽粒中锌主要来自花后吸收锌的再分配,在ZnF和ZnS+ZnF处理中的累积贡献率分别为89.9%和100.0%,锌肥回收率分别较ZnS提高4.8和1.1倍,锌肥利用率分别提高7.9和2.2倍。当前生产条件下,当施氮量<240 kg·hm^-2时,小麦不同器官锌浓度和锌累积量均随施氮量的增加而提高,喷施锌肥可显著提高籽粒中的锌浓度和锌累积量。因而,生产中可通过维持高产施氮方案并结合生育后期喷施锌肥的措施来提高籽粒中的锌浓度和锌累积量,从而提高小麦籽粒锌营养品质。     

重组人粒细-巨噬细胞集落刺激因子在毕赤酵母中的表达及活性分析

目的:利用毕赤酵母野生型菌株GS115(his4)和突变型菌株GJK01(ura3,adel,arg4,his4,ochl)表达人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF),并对其活性及糖基修饰情况进行比较.方法:用PCR技术扩增目的基因,引入Xho I、NotⅠ双酶切位点,构建pPIC9-hGM-CSF表达载体,电击转化毕赤酵母GS115和GJK01感受态细胞,得到工程菌;经甲醇诱导,对其表达产物进行糖基分析和生物学活性分析.结果:hGM-CSF在野生型菌株GS115和突变型菌株GJK01中均得到表达,其中野生菌表达的为过度糖基化的糖蛋白,而突变型菌株表达的为低糖化的糖蛋白,且二者均可刺激TF-1细胞的生长,比活性分别为9.79x105和2.21x10s U/mL.结论:利用酵母工程菌表达了低糖化的重组hGM-CSF,为其药物研究提供了新的思路,也为酵母的糖基工程改造提供了良好的糖蛋白模型.