铁蛋白装载“铁-阿霉素”新策略

铁蛋白具备独特的笼状结构、自组装特性、内在的肿瘤靶向性、良好的生物相容性以及易于规模化生产等优势,是一种具有良好转化前景的纳米药物载体.目前,关于铁蛋白装载抗肿瘤药物阿霉素(doxorubicin, Dox)的研究较多,装载策略包括被动装载和主动内化两类,其中,预先螯合金属离子形成"金属-阿霉素"复合物以促进其主动进入铁蛋白内腔的装载方法具有装载量高、杀伤效应强等特点,然而,此类方法仍存在铁蛋白回收率低、蛋白完整性受损等缺陷.为此,本文结合温度孵育法,利用人重组重链铁蛋白(human heavy chain ferritin, human HFn)发展了一种基于铁离子的"金属-阿霉素"装载新策略,成功构建了"铁蛋白-铁-阿霉素"(HFn(Fe-Dox), HFeD)药物递送系统,该系统具有高装载量(80～100个/HFn)、高包封率(50%～63%)和高蛋白回收率(80%～90%)的特点.同时,该策略很好地保留了铁蛋白的结构完整性、肿瘤靶向性和药物释放可控性,因而保证了HFeD对肿瘤细胞的特异靶向和杀伤.该方法的报道有望增加HFeD成药的可能性,推动铁蛋白药物载体的发展与应用.     

基于近红外荧光制剂的多模态多功能分子影像技术在肿瘤模型中的应用

多模态融合的分子影像技术整合了多种分子影像技术的优势,已成为当前分子影像领域研究的热点和发展趋势。新近报道的七甲川菁(heptamethine cyanine)染料是一类具有肿瘤靶向性的近红外荧光(nearinfrared fluorescence,NIRF)制剂。该染料独特的光学特征使其在肿瘤分子影像、靶向治疗和药物传递系统方面具有广阔的应用前景。纳米材料包裹该类染料可用于NIRF/MRI双模成像,标记核素后可实现NIRF/PET双模成像,共轭结合化疗药物后,可实现抗肿瘤药物的靶向传递,多个七甲川菁染料的复合物已被用作多模态成像,成为光热、光动力学和组合治疗肿瘤的新策略。     

以叶酸偶联纳米Fe_3O_4颗粒的合成和标记肿瘤实验研究

目的:研究叶酸偶联的超顺磁Fe3O4纳米颗粒对活体肝癌标记效果和MRI成像功能。方法:以铁盐、十二烷基苯磺酸和3-氨基丙基3-乙氧基硅烷为原料,通过共沉淀法合成了APTES修饰的超顺磁Fe3O4纳米颗粒,通过酰胺化法合成了叶酸偶联的超顺磁Fe3O4纳米颗粒,以X射线衍射仪、透射电镜、红外光谱仪、振动样品磁强计、动态光散射仪对合成材料进行表征,采用SRB法对叶酸偶联的超顺磁Fe3O4纳米颗粒细胞进行安全性检测,同时建立活体瘤鼠动物模型,对其在叶酸偶联的超顺磁Fe3O4纳米颗粒标记前后进行MRI成像对比检测,每个肿瘤组织块各取2套切片,分别行苏木素-伊红染色和普鲁士蓝染色,观察肿瘤组织光镜下形态及组织内含Fe情况。结果:所制备的叶酸偶联的Fe3O4纳米颗粒为立方相的Fe3O4,粒径约8 nm左右,水合直径25.7nm,呈近似球形,表面分布有羧基等功能基团,呈超顺磁特性,饱和磁化强度为51 emu/g Fe。叶酸偶联的超顺磁Fe3O4纳米颗粒对人皮肤成纤维细胞(HSF)的生长与生理盐水对照组的影响一样,无明显抑制细胞生长的表现。同时,磁共振成像和染色结果均显示肿瘤的存在。结论:叶酸偶联的超顺磁Fe3O4纳米颗粒,不仅细胞毒性小,而且因其表面的叶酸与叶酸受体之间的高强结合力。同时,它能通过这种结合作用被高效介导进入肿瘤细胞内,增强MRI成像中肿瘤组织与周围正常组织的对比度,有利于肿瘤细胞的标记、示踪和靶向检测,是一种很有应用前景的肿瘤细胞靶向检测物质。     

一种人源抗狂犬病病毒单克隆抗体的瞬时表达及性质分析

目的瞬时表达人源重组抗狂犬病病毒单克隆抗体,并对抗体性质进行分析。方法 PCR法扩增抗体轻、重链可变区并分别构建真核表达质粒;瞬时转染HEK293 EBNA1细胞;抗体经亲和纯化后,CE-SDS法分析纯化后抗体单体比例,用快速荧光灶抑制试验(RFFIT)分析抗体体外抗狂犬病病毒中和活性,ELISA分析抗体与3aG、CTN、PV及CVS株的结合。结果提取瞬时表达质粒的A260/280 nm比值在2.0～2.1之间纯化后抗体非还原CE-SDS单体纯度为74.4%;还原CE-SDS抗体轻、重链峰合计占比超过95%;抗体RFFIT体外中和活性为293.37 IU/mL,比活达628.21 IU/mg,抗体与3aG、CTN、PV及CVS株交叉反应均为阳性。结论该株抗体具有较高体外抗狂犬病病毒中和活性,与主要疫苗株均有较强结合。     

七甲川花菁染料作为肿瘤靶向和光动力治疗载体的研究进展

七甲川花菁近红外荧光染料(NIRF)可直接被肿瘤细胞特异性吸收,具有肿瘤靶向性。与化疗药物偶联后,该类染料可通过血脑屏障将药物转运至肿瘤部位,不仅可以减少化疗药物使用剂量,降低药物的毒副作用,也可通过近红外荧光成像实现对肿瘤治疗的实时监控。七甲川花菁染料所展示的线粒体毒性和光敏特性,可直接杀死肿瘤细胞,抑制肿瘤新生血管的形成。通过纳米包裹,能够显著增强该类染料的肿瘤靶向能力,实现实时跟踪药物释放情况。七甲川花菁染料特异性识别肿瘤细胞的能力与有机阴离子转运肽的作用密切相关,缺氧和线粒体膜电位也参与了染料吸收的调控。这些发现有利于将近红外荧光染料应用于肿瘤的靶向治疗。     

抗肿瘤抗体-药物偶联物的临床研究进展

个体化靶向治疗已成为肿瘤临床治疗的新趋势.抗肿瘤靶向药物与传统的细胞毒性化疗药物相比具有特异性高、选择性强和非细胞毒性等优点,近年来发展迅速.抗体-药物偶联物(ADCs)属于抗肿瘤靶向药物,由抗体、“弹头”药物(细胞毒性药物)通过链分子连接而成.ADCs将抗体的靶向性与细胞毒性药物的抗肿瘤作用相结合,可以降低细胞毒性抗肿瘤药物的不良反应,提高肿瘤治疗的选择性,还能更好地应对靶向单抗的耐药性问题.目前,FDA已批准2种ADC药物上市,即Mylotarg和Adcetris,有多种ADCs处于Ⅰ～Ⅲ期临床试验阶段,取得了显著的临床效果.本文概述了以美登素,卡奇霉素、Auristantin等三种细胞毒性药物为“弹头”药物的ADCs药物的临床研究状况及临床试验结果,为ADCs的研究和应用提供参考.     

Anti EGFR scFv::FTH1/FTH1纳米粒子的制备及其在哮喘治疗中的应用

哮喘作为常见的呼吸性疾病之一,严重危害人类的健康,造成了严重的医疗负担。最新研究表明表皮生长因子受体 (Epidermal growth factor receptor,EGFR) 参与哮喘的发生发展。为构建靶向EGFR用于哮喘治疗的纳米粒子,通过基因工程方法将抗EGFR的单链抗体 (Single chain antibody fragment,scFv) 修饰在铁蛋白重链亚基 (Human ferritin H-chain,FTH1) N端,采用混合复性的方式成功构建anti EGFR scFv::FTH1/FTH1纳米粒子。通过透射电子显微镜对纳米粒子的结构进行分析,结果表明,纳米粒子可以自组装成中空笼状结构,粒径约为12 nm。采用SDS-PAGE对纯化后的纳米粒子进行半定量分析发现,亚基物质的量之比为FTH1︰anti EGFR scFv::FTH1=7︰3。在哮喘小鼠动物模型上发现Anti EGFR scFv::FTH1/FTH1纳米粒子能有效抑制哮喘小鼠肺组织中杯状细胞增生及粘液分泌,对胶原沉积纤维化也有一定抑制效果。这些研究为铁蛋白应用于哮喘的治疗提供了良好的基础。     

基于磁性纳米材料的肿瘤靶向治疗研究进展

磁性纳米材料具有独特的磁学性质，可响应外磁场，产生力、热等效应。如在静磁场下将药物磁靶向递送至肿瘤部位；低频交变磁场下可将纳米药物主动渗透至病灶部位，实现瘤内均一分布；中频交变磁场作用下磁滞损耗产生热和增强的活性氧，用于肿瘤治疗。磁性纳米材料同时具有尺寸依赖的磁学性质以及表面多功能化等特点，可将磁靶向、分子靶向以及磁热疗联合。此外，磁性纳米材料具有磁共振成像性能以及纳米酶催化特性，使其在肿瘤诊疗一体化治疗方面获得了广泛应用。近年来，纳米给药系统不断被优化，基于磁性纳米材料的肿瘤靶向治疗也得到了长足的发展。鉴于此，本文围绕提高靶向肿瘤治疗效果，从磁靶向药物治疗、被动靶向磁热疗和主动分子靶向磁热疗、纳米酶特性以及诊疗一体化应用等几方面出发，综述了基于磁性纳米材料的肿瘤靶向治疗研究进展。     

靶向人表皮生长因子受体3的人源Fab抗体构建及鉴定

目的:制备靶向人表皮生长因子受体3(HER3)的全人源Fab型抗体,并对其亲和力及生物学活性进行鉴定。方法:用Bsp QⅠ限制性内切酶分别将靶向HER3的全人源抗体的完整轻链、重链的可变区全长和CH1恒定区插入载体p3457,构建重组质粒;通过将轻、重链质粒瞬时共转染293E悬浮细胞进行表达,并利用镍柱纯化得到Fab型抗体蛋白;采用ELISA鉴定其与HER3胞外区是否结合,Forte Bio实验鉴定其亲和力,CCK8检测其对MDA-MB-453细胞增殖能力的影响。结果:分别获得表达轻链全长、重链可变区全长及CH1恒定区的HER3抗体重组质粒,并通过瞬时共转染293E悬浮细胞获得分泌型HER3 Fab抗体;ELISA实验证明其可与HER3胞外区蛋白直接结合;Forte Bio实验证明Fab型抗体与人源HER3胞外区蛋白具有一定的亲和力(KD=1.08×10-8mol/L);体外增殖实验表明,该抗体可显著抑制MDA-MB-453体外增殖。结论:通过293E悬浮细胞表达、镍柱亲和纯化,获得具有较高亲和力和功能活性的HER3 Fab型抗体,为HER3高表达型癌症的诊断、治疗提供物质基础。     

四氧化三铁–阿霉素纳米复合物对小鼠乳腺癌的靶向治疗效果

该文探究了四氧化三铁搭载的阿霉素纳米复合物对小鼠乳腺癌的靶向性和治疗效果。采用共沉淀法制备羧甲基壳聚糖修饰的纳米四氧化三铁,通过羧甲基壳聚糖的羧基和阿霉素的氨基的静电作用,组成纳米复合物。利用透射电镜、傅里叶红外光谱、超导量子干涉磁强计等对制备的纳米四氧化三铁和羧甲基壳聚糖修饰的四氧化三铁进行表征,观察其形貌特征。小鼠活体成像观察所制备的纳米复合物对荷瘤小鼠的靶向作用。荷瘤小鼠肿瘤生长抑制实验考察纳米复合物对肿瘤的治疗作用。结果显示,制备的羧甲基壳聚糖修饰的四氧化三铁粒径约为10 nm,搭载阿霉素后仍保留纳米四氧化三铁的超顺磁性。小鼠活体成像显示,纳米复合物能在肿瘤区域富集。小鼠肿瘤生长抑制实验显示,具有较单独使用阿霉素更好的抑癌效果。结果表明,所制备的四氧化三铁–阿霉素纳米复合物对肿瘤组织具有靶向性和更好的抑癌效果。     

单克隆抗体ND-1-量子点荧光探针对大肠癌细胞的特异成像研究

目的制备抗人大肠癌单克隆抗体ND-1的量子点荧光探针,实现对大肠癌细胞的靶向成像。方法采用共价偶联方法,以1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)为缩合剂,通过在反应体系中加入不同摩尔比例的单克隆抗体ND-1和游离量子点QD605进行条件优化,制备偶联产物ND-1-QD605荧光探针;利用荧光光谱扫描技术对ND-1-QD605进行光学特性表征,并检测其抗光漂白能力;利用免疫荧光方法检测ND-1-QD605对大肠癌细胞的靶向结合能力。结果在量子点QD605与单克隆抗体ND-1摩尔比1:40条件下,可实现二者的高效偶联;荧光光谱分析显示ND-1-QD605保留了游离量子点QD605优良的荧光特性;在激发光照射1h内,ND-1-QD605荧光强度未发生明显改变;荧光显微镜观察可见该探针能够与表达有相应抗原LEA的人大肠癌CCL187细胞特异性结合,呈现高灵敏度、特异性荧光成像。结论制备的单克隆抗体ND-1的量子点荧光探针具有大肠癌细胞靶向成像能力,有望为大肠癌的体内靶向成像研究和临床诊断提供新方法。     

ADC药物的抗体组成及其作用靶点研究进展*

抗体药物偶联物(antibody-drug conjugates,ADC)是一类由单克隆抗体和小分子细胞毒性药物通过连接子偶联而成的新型生物治疗药物。与传统的细胞毒药物相比,ADC具有靶向性强、毒副作用小等优势,在临床上展现较好的治疗潜力。其中,抗体部分通过与肿瘤细胞表面的靶向抗原结合,精准地将小分子细胞毒性药物递送至肿瘤部位,从而实现肿瘤特异性杀伤效果,是影响ADC疗效的核心要素之一。对近年来ADC药物中抗体的组成及其作用靶点的研究进展进行了综述。     

含RGD修饰的病毒样颗粒递送ICG靶向肿瘤的研究

目的:获取含RGD靶向肽的乙肝核心病毒样颗粒,为药物靶向纳米递送系统提供一种新型载体。方法:将实验室前期构建测序正确的含RGD修饰的乙肝核心病毒重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,单因素分析及正交试验探究重组蛋白最适表达条件。在最适表达条件下扩培,收集菌体超声破碎后离心,采用凝胶过滤层析、离子交换和蔗糖密度梯度离心进行纯化,利用透射电镜对形成的RGD-HBc VLPs的形态及稳定性进行鉴定。纯化的RGD-HBc VLPs利用其体外自组装的特性,将光敏剂ICG装载到颗粒的内部,通过静脉注射到4T1乳腺癌荷瘤小鼠,探究重组RGD-HBc VLPs作为纳米递送系统的靶向性。结果:RGD-HBc VLPs在温度32℃、IPTG0.5mmol/L、诱导4h时以可溶性蛋白的形式得到高效表达。经蔗糖密度梯度离心纯化后纯度到达95%以上。透射电镜下观察纯化的RGD-HBc VLPs形态、大小均一,直径约为32nm,通过近红外荧光活体成像证实了RGD-HBc作为纳米载体的靶向性。结论:经表达和纯化后,RGD-HBc VLPs具有较高的表达量和大小均一的形态外貌,近红外荧光活体成像证实具有较好的靶向性,这不仅为肿瘤的可视化诊断提供一种快速、精准、方便的方法,而且为今后靶向免疫治疗提供一种新型载体。     

人源抗狂犬病病毒单克隆抗体的构建及验证

目的利用人源抗狂犬病病毒ScFv噬菌体抗体库,构建单克隆抗体(单抗)轻、重链质粒,瞬时表达,纯化后验证具有高中和活性的单抗。方法以从ScFv噬菌体抗体库中筛选获得特异性抗体为模板,PCR扩增抗体轻、重链可变区序列,构建人源全分子抗体瞬时转染质粒;轻、重链质粒混合后转染HEK293 EBNA1细胞,瞬时表达全分子抗体。采用Mabselect SuRe介质手动亲和纯化抗体,Nano Vue超微量分光光度计测定蛋白质的质量浓度,快速荧光灶抑制试验(rapid fluorescent focus inhibition test, RFFIT)进行体外中和效价验证。结果成功构建22个轻链质粒,15个重链质粒。通过真核细胞瞬时表达后,经手动亲和纯化后,获得22株单抗。除1株抗体外,其余21株抗体的蛋白质量浓度均>300μg/mL;部分抗体纯度均在90%以上。中和活性结果显示,5株在1 500~1 800 IU/mg之间;8株在800~1 500 IU/mg之间;7株在500~800 IU/mg之间;其余2株在500 IU/mg以下。结论成功构建并验证获得20株中和活性>500 IU/mg的人源抗狂犬病病毒单抗,为单抗混合制剂的研究奠定了基础。     

基于巨噬细胞的诊疗一体化系统

目的:建立一种可以同时实现显像诊断与主动靶向到肿瘤部位进行治疗的纳米药物模型。方法:包载了1,1'-二十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚三碳花青碘(1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindotricarbocyanine iodide, Di R)荧光染料的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(Polylactic-co-glycolic acid, PLGA)纳米粒表面被金属离子与酚羟基络合形成的网状结构涂布后可稳定连接在巨噬细胞表面,Di R可以在近红外激光下实现荧光成像,并经波长为808 nm的近红外激光器以2 W/cm2功率照射,产生光热作用。结果:构建了粒径在100 nm左右的包载了Di R的PLGA纳米粒,表面涂布金属多酚网状结构后,纳米粒连接到巨噬细胞表面,Di R发挥既可荧光成像,经808 nm激光照射后又可高效升温至46℃以上,使用CCK8试剂检测证明此种连接了纳米粒的功能化细胞(Functional Cell)发挥光热作用后可杀死近70%的小鼠乳腺癌细胞4T1。结论:成功建立了一种基于巨噬细胞递送的诊疗一体化系统,将荧光成像与光热治疗有机结合到一起,达到有效杀伤肿瘤细胞的功效。     

促进大肠杆菌周质空间小分子抗体表达的菌种构建方法*

目的:构建一株表达TNF-α Fab'抗体的大肠杆菌工程菌,并设计一种高效实用的策略以促进大肠杆菌周质空间的可溶性Fab'抗体表达。方法:首先,通过更换不同表达载体,改变轻链和重链顺序,更换信号肽,共表达分子伴侣(Skp)、二硫键合成酶(Dsbc)、肽基辅氨酰顺反异构酶(PPIB)、二硫键异构酶(hPDI)、核酸酶(Nuclease),以评估对Fab'抗体表达量的改善。其次,纯化表达的Fab'抗体。通过周质提取、Q阴离子交换柱净化、苯基柱捕获、Protein L柱亲和三步纯化方案得到高纯度的Fab'抗体。最终将纯化后的Fab'抗体进行亲和力测定。结果:提高正确组装的Fab'抗体表达量的策略有——将目的蛋白构建至pET-30a载体;重链在前、轻链在后;轻、重链采用相异的信号肽;共表达hPDI。周质提取液中的Fab'抗体浓度达到588.0mg/L提取液,纯化后产量可达28.2mg/L发酵液,总回收率为32.0%,纯度为90.9%。Fab'抗体亲和力为(5.8±3.0)×10^-9mol/L,体外细胞学活性IC₅₀为(5.2±2.4)×10^-11mol/L。结论:通过大肠杆菌工程菌分子构建方式的优化,得到了一株高效表达可溶性Fab'抗体的工程菌株,为可溶性小分子抗体的规模化生产奠定了研究基础。     

叶酸受体介导的负载紫杉醇纳米药物输送系统的制备

目的:构建靶向肿瘤组织的药物输送系统,是解决目前临床肿瘤化疗问题的有效途径之一.我们拟开展叶酸受体介导的负载紫杉醇纳米药物输送系统的制备及其表征.方法:以丁二酰化肝素为载体,通过碳二亚胺法将叶酸和丁二酰化肝素连接,制备肝素-叶酸偶联物,然后通过物理方法将紫杉醇包裹在肝素-叶酸偶联物中,在水溶性条件下体系自组装成肝素-叶酸-紫杉醇纳米粒.应用核磁共振氢谱(1H NMR),动态光散射(DLS)和扫描电子显微镜(SEM)对构建的纳米药物结构进行表征,同时观测其在水溶性条件下的自组装行为.结果:成功制备了肝素-叶酸-紫杉醇纳米药物输送系统,检测表明药物系统带有8.5％(w/w)的叶酸并负载9.6％(w/w)的药物,SEM检测表明形成了球状的纳米颗粒,DLS表明粒子的粒径在了86 nm左右.结论:我们成功制备了叶酸受体介导的负载紫杉醇的纳米药物输送系统,在进一步开展的生物活性的检测中,希望通过叶酸受体的靶向作用,引导药物定向分布在肿瘤组织,从而提高化疗药物的治疗效果同时降低其对正常细胞的毒副作用,为开发新型靶向药物输送系统提供基础.     

抗HER2人源化单克隆抗体在毕赤酵母中的表达及其产物分析

目的:研究抗人表皮生长因子受体2(HER2)人源化单克隆抗体能否在毕赤酵母中表达,并对表达产物进行结构分析和活性测定.方法:合成抗HER2人源化单克隆抗体的全基因,构建轻重链双表达盒表达载体,转入毕赤酵母中;通过表型筛选和诱导表达实验得到抗体表达工程菌,对表达产物进行分离纯化和活性测定.结果:表达产物存在于表达上清中,摇瓶表达水平达到53.7±2.9 mg/L;毕赤酵母表达的抗体的轻重链能够自发通过二硫键装配成正确的抗体结构,其中重链发生了N-糖基化;酵母表达的抗HER2人源化单克隆抗体可以抑制高表达p185(abR2)肿瘤细胞SKBR-3的生长,半数有效浓度为0.17 mg/L.结论:实现了抗HER2人源化单克隆抗体在毕赤酵母中的表达,为毕赤酵母表达系统成为抗体等人用剂量较大的复杂型糖蛋白的大规模、低成本制备平台提供了基础.     

鲫鱼血清和皮肤粘液IgM的分离纯化及部分性质的鉴定

采用盐析法结合葡聚糖凝胶柱 ,分离纯化鲫鱼血清IgM ;然后制备兔抗鲫鱼血清IgM多克隆抗体 ,将其偶联到Sepharose 4B上制成亲和柱 ,用于分离纯化皮肤粘液IgM。结果表明 :33%～ 4 5 %硫酸铵溶液沉淀处理可以去除鲫鱼血清中除IgM外的很多杂蛋白 ,再经葡聚糖凝胶柱纯化 ,IgM纯度可达 80 %以上 ,其重链和轻链的分子量分别为 79和 2 5kDa ;以兔抗鲫鱼血清IgM多克隆抗体亲和柱分离皮肤粘液IgM ,分离效果良好 ,IgM重链的分子量为 88kDa ;Westernblot显示兔抗鲫鱼血清IgM多克隆抗体识别的是血清和皮肤粘液IgM的重链部分。用ELISA测定鲫鱼血清中IgM含量在一年中的变化 ,结果表明IgM在春夏季的含量高于秋冬季     

抗体与小分子药物一体化的完美“联姻”——解析抗体-药物偶联物之定点偶联

基于单抗的靶向疗法已成为各种癌症的重要治疗手段,抗体与小分子药物一体化的联姻——抗体—药物偶联物（antibody-drug conjugates,ADC）新药获得了突破性进展。传统ADC是将药物与抗体的赖氨酸残基或链间二硫键还原而产生的半胱氨酸残基相偶联 而形成,其稳定性差,易发生聚集,且其中药物易脱落而产生非治疗性毒副作用。而应用近年发展起来的定点偶联技术所获ADC,除均 一性好外,还保留了母体单抗的药动学性质,毒副作用也远低于具有相同偶联比的传统ADC,极有可能发展成为新一代重磅药物。综述 4种ADC定点偶联方法。