靶向肿瘤新生血管纳米粒的构建和质量控制

目的：制备F56多肽修饰的长春新碱纳米粒（F56-VCR-NP）,并建立其质量控制方法。方法：乳化－溶剂挥发法优化制备F56．VCR-NP：HPLC法测定其载药量、包封率,透射电镜下观察其形态,激光粒度分析仪测定其粒径和Zeta电位,CBQCA试剂盒测定纳米粒表面多肽密度,XPS进行表面元素分析。结果：优化制备的F56－VCR-NP粒径约为153nm,Zeta电位为－20．8mv,包封率为21．4％,载药量为1．9％,多肽连接效率为26．3％。结论：以聚乙二醇－聚乳酸（PEG-PLA）为原料,长春新碱为模型药物,成功制备出纳米粒子,并建立起有效的质量控制方法,对该实验样品进行了表征。结果表明此类纳米粒子尺寸均匀,表面多价连接F56多肽,载药量和包封率稳定可控,工艺成熟。     

基于巨噬细胞的诊疗一体化系统

目的:建立一种可以同时实现显像诊断与主动靶向到肿瘤部位进行治疗的纳米药物模型。方法:包载了1,1'-二十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚三碳花青碘(1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindotricarbocyanine iodide, Di R)荧光染料的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(Polylactic-co-glycolic acid, PLGA)纳米粒表面被金属离子与酚羟基络合形成的网状结构涂布后可稳定连接在巨噬细胞表面,Di R可以在近红外激光下实现荧光成像,并经波长为808 nm的近红外激光器以2 W/cm2功率照射,产生光热作用。结果:构建了粒径在100 nm左右的包载了Di R的PLGA纳米粒,表面涂布金属多酚网状结构后,纳米粒连接到巨噬细胞表面,Di R发挥既可荧光成像,经808 nm激光照射后又可高效升温至46℃以上,使用CCK8试剂检测证明此种连接了纳米粒的功能化细胞(Functional Cell)发挥光热作用后可杀死近70%的小鼠乳腺癌细胞4T1。结论:成功建立了一种基于巨噬细胞递送的诊疗一体化系统,将荧光成像与光热治疗有机结合到一起,达到有效杀伤肿瘤细胞的功效。     

巨噬细胞装载纳米颗粒用于药物递送

目的:活细胞药物递送系统具有主动靶向至肿瘤部位,防止被免疫系统清除等诸多优势。本文提供了一种巨噬细胞负载纳米颗粒的递送方法,并探讨不同载药量对巨噬细胞的活性以及运动性的影响。方法:通过超声乳化法制备包载阿霉素的DOX@PLGA纳米颗粒。纳米粒度分析仪测量粒径和表面电位,透射电镜观察纳米颗粒形态。将DOX@PLGA纳米颗粒与巨噬细胞共同孵育,即得到负载DOX@PLGA纳米颗粒的巨噬细胞用以药物递送。然后通过CCK-8法、LDH法以及细胞迁移实验检测不同载药量情况下细胞活力水平、细胞损伤程度以及细胞运动性。结果:制备的DOX@PLGA纳米颗粒呈圆形或椭圆形,粒径为109.2±2.3 nm;表面电位为-45.0±2.0 m V;载药量为4.61%。当单个巨噬细胞负载0.15 pg DOX时细胞存活率为:71.5±4.4(%);细胞损伤率为:26.3±1.8(%);迁移率为:61.6±5.7(%)。结论:成功制备巨噬细胞负载DOX@PLGA纳米颗粒的递药系统,载药量适当的情况下载体细胞依然具有良好的活性和运动性。     

巨噬细胞膜伪装纳米颗粒的制备和功能表征

摘要 目的：巨噬细胞具有炎症趋化能力,近年来巨噬细胞膜伪装的纳米递送载体引起研究者的广泛关注。本文提供了一种巨噬细胞膜伪装纳米颗粒的方法,即摄取-挤出法,并对该法制得的纳米颗粒进行表征,考察纳米颗粒在不同细胞中的摄取。方法：利用溶胶-凝胶法制备装载阿霉素的介孔硅（DMSN）纳米颗粒,再利用RAW 264.7巨噬细胞吞噬DMSN,最后将巨噬细胞连续挤出制得巨噬细胞膜伪装的载有阿霉素的介孔硅（DMSN@CM）纳米颗粒。动态光散射激光粒度仪（DLS）测定DMSN@CM颗粒的粒径和表面电位,透射电子显微镜（TEM）观察纳米颗粒形态,聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）验证细胞膜的成功伪装。然后通过激光共聚焦显微镜与流式细胞术共同考察了DMSN@CM在不同细胞中的摄取情况。结果：成功制备了DMSN和DMSN@CM纳米颗粒。DMSN粒径为116.7±3.2 nm,zeta表面电势为 -29.5± 1.3 mV;MSN@CM粒径为128.0±9.3 nm,zeta表面电势为 -26.7 ±1.2 mV。TEM与SDS-PAGE共同验证了DMSN@CM表面细胞膜的成功包覆。细胞摄取试验表明巨噬细胞膜的伪装可以抑制RAW 264.7细胞对DMSN@CM的摄取;促进MDA-MB-231细胞对DMSN@CM的摄取。结论：利用摄取-挤出法成功构建了DMSN@CM纳米颗粒,该法简便高效,为纳米颗粒的细胞膜伪装提供了一种新的手段。     

用于核酸递送的GSH响应型纳米粒构建

摘要 目的：核酸治疗近年来越来越受到关注,但是核酸药物易被快速清除、易被核酸酶降解、非特异性生物分布、以及不易被细胞摄取的缺点使其在体内难以发挥效果。本文提供了一种具有谷胱甘肽（GSH）响应性释放的纳米粒,能够进行有效核酸药物递送。方法：使用十六烷基三甲基氯化铵（CTAC）制备介孔硅纳米粒,在介孔硅纳米粒表面进行巯基修饰并活化,使其与巯基修饰的聚丙烯亚胺和聚乙二醇反应,形成具有GSH响应的介孔硅纳米粒,通过静电吸附进行核酸荷载。马尔文粒度仪测量表面电位、粒径,透射电镜观察纳米粒形态。核酸电泳检测其核酸负载效率,通过体外检测GSH响应释放聚乙烯亚胺（PEI）情况,共聚焦显微镜观察细胞摄取以及溶酶体逃逸情况。结果：成功构建了具有GSH响应的纳米粒,粒径为76.44±1.68 nm,表面电位为33.93±0.59 mV;通过透射电镜观察到纳米粒呈圆形带孔颗粒状;琼脂糖核酸负载试验观察到当氮磷比大于20时,能够有效进行核酸负载。共聚焦显微镜显示该纳米粒能够成功被MDA-MB-231乳腺癌细胞摄取。在溶酶体逃逸试验中观察到纳米粒进入细胞后3 h,Cy5-siRNA与溶酶体的荧光分离,证明构建的纳米粒成功从溶酶体逃脱。结论：成功构建了具有GSH响应的介孔硅纳米粒,能够有效用于核酸递送。     

脓毒症患儿高营养风险的影响因素及其对免疫功能、微量元素和疾病转归的影响

摘要 目的：研究脓毒症患儿高营养风险的影响因素及其对免疫功能、微量元素和疾病转归的影响。方法：选取2019年1月-2021年12月我院收治的168例脓毒症患儿,采用营养状况和生长风险筛查工具（STRONGkids）筛查其营养风险,根据评分结果将营养风险患儿分为中低营养风险组与高营养风险组。比较两组临床资料,采用Logistic回归模型分析高营养风险的影响因素;比较中低营养风险组与高营养风险组免疫功能指标（CD4⁺、CD8⁺、CD4⁺/CD8⁺）,微量元素[铜（Cu）、铁（Fe）、锌（Zn）]含量及疾病转归情况。结果：经STRONGkids营养风险筛查结果显示,151例脓毒症患儿存在营养风险,营养风险发生率为89.88%,其中存在中低营养风险110例（中低营养风险组）和高营养风险41例（高营养风险组）。高营养风险组急性生理与慢性健康状况评分系统Ⅱ（APACHE Ⅱ）评分、乳酸、降钙素原水平及严重脓毒症占比高于中低营养风险组,白蛋白水平低于中低营养风险组（P＜0.05）。多因素Logistic回归分析显示,APACHE Ⅱ评分升高、严重脓毒症是脓毒症患儿发生高营养风险的危险因素（P＜0.05）,白蛋白升高是脓毒症患儿发生高营养风险的保护因素（P＜0.05）。高营养风险组CD4⁺、CD4⁺/CD8⁺低于中低营养风险组,CD8⁺高于中低营养风险组（P＜0.05）。两组Cu含量差异无统计学意义（P＞0.05）,高营养风险组Fe、Zn含量低于中低营养风险组（P＜0.05）。中低营养风险组好转74例、未愈32例、死亡4例,高营养风险组好转19例、未愈15例、死亡7例,高营养风险组疾病转归良好率低于中低营养风险组（P＜0.05）。结论：脓毒症患儿高营养风险发生率较高,严重脓毒症、APACHE Ⅱ评分、白蛋白水平为高营养风险的影响因素,且高营养风险导致患儿免疫功能下降,体内Fe、Zn含量降低,疾病转归情况较差,建议早期实施营养干预,改善患儿的预后。     

pH敏感纳米粒的制备和功能表征

目的:制备具有pH响应的甲氧基聚乙二醇甲基丙烯酸-2-六亚甲基亚胺乙酯聚合物,测试材料pH功能响应,以及建立聚合物纳米粒载药方法。方法:通过核磁共振氢谱鉴定ATRP(Atom Transfer Radical Polymerization)聚合反应所获得的化合物结构。滴加-搅拌挥发法制备聚乙二醇甲基丙烯酸-2-六亚甲基亚胺乙酯纳米粒,酶标仪测定其载药量和包封率。透射电镜下观察其形态,激光粒度仪分析测定其粒径,包载DiR红外荧光探针检测纳米粒pH响应功能。结果:分别成功合成得到2-溴代异丁酸聚乙二醇单甲醚和甲基丙烯酸-2-六亚甲基亚胺乙酯单体。通过ATRP聚合反应成功合成聚乙二醇甲基丙烯酸-2-六亚甲基亚胺乙酯聚合物材料,并通过核磁氢谱对聚合材料进行鉴定。通过滴加搅拌法制备包载有模型药物香豆素-6的纳米粒,并对纳米粒的形态表征及载药量进行测定。结论:试验结果表明制备得到的聚合物纳米粒尺寸均匀,具有预期的pH响应效果,可以装载模型药物。     

KCa3.1通道参与调控星形胶质细胞糖氧剥夺诱导的内质网应激

目的:研究KCa3.1在糖氧剥夺诱导的原代星形胶质细胞内质网应激(ERS)中的调控作用。方法:通过构建原代星形胶质细胞糖氧剥夺(OGD)模型,应用cck-8法、免疫荧光技术、western blotting等分子生物学技术研究KCa3.1在OGD引起的原代星形胶质细胞内质网应激中的作用。结果:OGD 4 h处理后星形胶质细胞内KCa3.1的表达明显上调。OGD处理后星形胶质细胞的细胞活力显著性降低,且具有时间依赖性。给予KCa3.1通道抑制剂TRAM-34可提高OGD 4 h处理后星形胶质细胞的细胞活力,并具有剂量依赖性。OGD处理0.5 h、1 h、3 h、4 h、6 h后,原代星形胶质细胞内ERS信号通路被激活,GRP78、p-eIF-2α的表达显著性上调。给予KCa3.1通道抑制剂TRAM-34后,OGD引起的星形胶质细胞内GRP78、p-eIF-2α的上调幅度显著性降低。结论:KCa3.1通道参与了星形胶质细胞内OGD引起的内质网应激通路的激活。     

嵌合型E1B 55-kDa蛋白缺陷型腺病毒载体治疗肿瘤的评价

ONYX-015和H101为可复制E1B 55-kDa蛋白缺陷的C族腺病毒,它们正作为抗癌药物进行临床研究. 然而它们在癌症基因治疗中的应用却受到了C族腺病毒天然特性的制约,部分原因是由于在恶性肿瘤中C族腺病毒受体(coxsackievirus-adenovirus receptor,CAR) 的表达量较低. 构建了一个以H101为骨架的含有编码35型腺病毒鞭毛区域的基因,替代5型腺病毒鞭毛基因的嵌合型腺病毒载体. 这一改动使得腺病毒载体可以通过一种在肿瘤中高表达的膜蛋白CD46感染肿瘤细胞. 应用RT-PCR方法检测不同肿瘤细胞株中CAR和CD46表达量的区别. 在CAR受体低表达的细胞株中(MDA-MB-435和MCF-7),H101-F35表现出比H101和ONYX-015更强的细胞杀伤效果;在CAR受体高表达的细胞株中(A549,NCI-H446,Hep3B,LNCaP,ZR-75-30和Bcap-37),H101-F35、 H101和ONYX-015的细胞杀伤效果则相似. 在荷MDA-MB-435肿瘤的裸鼠模型中,注射H101-F35的抑瘤效果比注射H101的抑瘤效果更明显. 这些结果表明嵌合型溶瘤腺病毒载体H101-F35在肿瘤基因治疗中将有很好的应用前景.