H9N2亚型AIV HA基因的原核表达及间接ELISA方法的建立

根据GenBank公开发表的禽流感病毒(Avian Influenza Virus, AIV)H9N2亚型血凝素基因(HA)序列设计引物, 用PCR方法从重组质粒pUC-HA中扩增H9N2亚型禽流感病毒去除信号肽的血凝素基因 , 将该片段定向插入到原核表达载体pET-32a(+)中, 构建原核表达载体pET-HA.阳性质粒转化宿主菌BL21(DE3), 经IPTG诱导, HA基因获得表达, 经定位分析, 目的蛋白以包涵体的形式存在于大肠杆菌中.通过改变IPTG的浓度和诱导时间, 确定了表达HA基因的最佳诱导条件 IPTG 终浓度为0.7mmol/L , 诱导时间为3 h .Western-blot分析表明, 重组蛋白能与H9N2亚型AIV阳性血清发生特异性反应.以纯化后表达产物作为诊断抗原包被酶标板建立了检测H9亚型AIV抗体的间接ELISA方法.结果表明, 抗原的最佳包被浓度为25μg/mL, 血清的最佳稀释度为180, 阳性标准初步定为 OD待检血清＞0.5且OD标准阳性血清＞1.0 ; OD标准阴性血清＜0.1.     

H9N2亚型AIVHA基因的原核表达及间接ELISA方法的建立

根据GenBank公开发表的禽流感病毒(AvianInfluenzaVirus,AIV)H9N2亚型血凝素基因(HA)序列设计引物,用PCR方法从重组质粒pUCHA中扩增H9N2亚型禽流感病毒去除信号肽的血凝素基因,将该片段定向插入到原核表达载体pET32a(+)中,构建原核表达载体pETHA。阳性质粒转化宿主菌BL21(DE3),经IPTG诱导,HA基因获得表达,经定位分析,目的蛋白以包涵体的形式存在于大肠杆菌中。通过改变IPTG的浓度和诱导时间,确定了表达HA基因的最佳诱导条件:IPTG终浓度为0.7mmol/L,诱导时间为3h。Westernblot分析表明,重组蛋白能与H9N2亚型AIV阳性血清发生特异性反应。以纯化后表达产物作为诊断抗原包被酶标板建立了检测H9亚型AIV抗体的间接ELISA方法。结果表明,抗原的最佳包被浓度为25μg/mL,血清的最佳稀释度为1∶80,阳性标准初步定为:OD待检血清>0.5且OD标准阳性血清>1.0;OD标准阴性血清<0.1。     

禽流感病毒H7N2血凝素HA1基因在大肠杆菌中的表达

目的　表达H7N2亚型禽流感病毒 (AIV)HA1基因 ,用于感染H7亚型禽流感病毒抗体的检测和HA1蛋白功能研究。方法　采用RT PCR方法对H7N2亚型AIVHA1基因进行扩增 ,将PCR产物克隆于pGEM T Easy载体 ,将该基因插入pGEX 4T 2中构建HA1基因原核表达载体 ,转化BL2 1大肠杆菌后 ,在IPTG诱导下表达HA1蛋白 ,Westernblot鉴定表达HA1蛋白。电洗脱方法纯化表达HA1蛋白 ,建立间接ELISA方法 ,对感染AIVH7、H9、H5亚型AIV阳性血清进行检测。结果　成功克隆H7N2亚型AIV的HA1基因 ,其核苷酸序列长度 96 6bp ,编码 32 2个氨基酸残基。构建HA1基因原核表达载体在大肠杆菌内表达出约 6 1× 10 3的HA1融合蛋白。Westernblot和ELISA方法鉴定表明 :表达HA1蛋白与感染H7亚型AIV鸡血清有反应 ,与H5、H9亚型AIV阳性血清没有反应。结论　本研究在大肠杆菌中成功表达了H7N2亚型AIVHA1基因蛋白 ,具有与感染H7亚型AIV阳性血清反应原性 ,不与H5和H9亚型AIV感染阳性血清发生反应。     

H5N1亚型禽流感病毒血凝素基因的原核表达及间接ELISA方法的初步建立

根据GenBank公布的H5N1亚型禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)基因序列设计引物,用PCR方法扩增H5N1亚型禽流感病毒HA1基因, 将该片段定向插入到原核表达载体pET_32a(+)中,构建原核表达载体pET_HA1。阳性质粒转化宿主菌BL21(DE3), 经IPTG诱导, HA1基因获得表达, 重组蛋白以包涵体的形式存在。通过改变IPTG的浓度和诱导时间 , 确定了表达HA1基因的最佳诱导条件: IPTG终浓度为0.8mmol/L,诱导时间为3h。Western blot分析表明表达产物具有良好的免疫学活性。以纯化的表达产物作为诊断抗原建立了检测H5亚型AIV抗体的iHA_ELISA方法。结果表明,抗原的最佳包被浓度为4μg/mL,血清的最佳稀释度为1∶200, 阳性标准初步定为：OD待检血清＞05,且 OD待检血清/OD阴性血清＞2。     

H5N1禽流感病毒HA基因在昆虫细胞中的表达及生物活性鉴定

经RT-PCR扩增了H5N1亚型禽流感病毒血凝素基因(HA)片断,限制性内切酶酶切后将其克隆到pFastBacHTA杆状病毒转座载体,经酶切鉴定及测序,筛选出阳性重组转座载体pFastBac-H5。将pFastBacH5转化含有杆状病毒穿梭载体（bacmid）的DH10Bac感受态细胞,通过蓝白斑筛选和PCR鉴定获得重组杆状病毒穿梭载体rBacmid-H5。rBacmid-H5在脂质体介导下转染sf9昆虫细胞,SDS－PAGE蛋白电泳、Western blot、血凝试验和血凝抑制试验分析表明：分子量约63Kd重组血凝素蛋白（rH5）在sf9昆虫细胞中实现了高效表达。rH5具有血凝活性,而且其血凝活性能够被H5N1禽流感病毒高免血清所抑制;rH5免疫鸡诱导产生针对H5N1禽流感病毒亚型特异的血凝抑制抗体,说明表达的重组蛋白具有与天然蛋白相似的生物活性。     

禽流感病毒H9N2血凝素基因和神经氨酸酶基因在真核酵母菌中的表达

目的:克隆、表达和鉴定禽流感病毒H9N2血凝素基因(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶基因(neuramidinase,NA)序列,为制备抗体和基因工程疫苗打下基础。方法:在成功克隆禽流感病毒H9N2全长HA、NA基因并测序的基础上,将部分基因序列克隆到表达载体pMETA上,构建了重组表达质粒pMETA/HA(52～1545bp),pMETA/NA(121～1254bp),电转化真核酵母菌pMAD16,甲醇诱导表达,利用Ni2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,并用Western blotting和ELISA方法检测其抗原性。结果:重组蛋白在酵母菌中可以高效表达,SDS-PAGE显示蛋白表达后形成了二聚体,蛋白纯度占总蛋白的95%以上,ELISA和Western blotting实验证实,重组蛋白具有良好的抗原性。结论:成功克隆和表达了禽流感病毒H9N2HA、NA基因序列,为禽流感病毒H9N2诊断试剂和疫苗的开发等进一步的研究奠定了基础。     

H7N9亚型禽流感病毒非结构蛋白1(NS1)基因序列分析及2013上海分离株NS1的原核表达

目的:对2013年3月发生的感染人的新型H7N9亚型禽流感病毒的非结构蛋白1(NS1)基因序列进行同源性分析,构建NS1重组质粒并表达。方法:从GenBank获得2006~2013年不同来源的H7N9亚型病毒NS1序列,并进行同源性比较;利用PCR方法从H7N9亚型禽流感病毒株A/Shanghai/4664T/2013(H7N9)基因组cDNA中扩增得到全长NS1基因,并将该片段定向克隆到原核表达载体pET28a上,构建重组质粒pET28a-NS1,经酶切鉴定,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后,IPTG诱导表达,且进行Western印迹分析。结果:经序列分析,2013年暴发的H7N9型禽流感病毒的NS1基因核苷酸序列同源性为95%~100%,与之前暴发的H7N9型流感病毒NS1基因序列的同源性为86.4%~90.7%,表明2次暴发的该型流感分离株属于不同的进化分支;PCR扩增得到约680 bp的NS1基因序列,所克隆的NS1基因在原核细胞中的表达产物主要以包涵体形式存在,SDS-PAGE检测结果表明重组蛋白相对分子质量为25×103,Western印迹分析证实表达产物为H7N9禽流感病毒NS1蛋白。结论:为进一步研究H7N9亚型流感病毒NS1蛋白功能及基于NS1蛋白的抗病毒药物奠定了基础。     

H9N2亚型禽流感病毒HA基因在昆虫细胞中的表达

为了获得具有良好免疫活性的H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白,本研究利用Bac-to-Bac昆虫-杆状病毒表达系统对H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白进行表达。运用PCR对H9N2亚型禽流感病毒HA基因进行扩增,将HA基因连接于转移载体pFastBacDual的BamHⅠ和HindⅢ两个酶切位点之间,构成pFastBacDual-HA重组载体;将pFastBacDual-HA转化至大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,利用蓝白斑筛选法和PCR方法对阳性菌落筛选重组杆粒Bacmid-HA;重组杆粒Bacmid-HA对Sf9昆虫细胞进行了转染,获得重组杆状病毒rBV-HA;运用SDS-PAGE电泳和Western blotting分析rBV-HA感染的细胞和细胞上清。结果表明,重组HA蛋白大小约为65 kD;Western blotting分析显示,HA蛋白与免疫H9N2禽流感病毒后获得的阳性血清具有良好的特异性反应,为进一步研制针对HA蛋白的H9N2亚型AIV亚单位疫苗和研发H9亚型ELISA抗体检测试剂盒奠定了基础。     

H1亚型猪流感病毒抗体间接ELISA检测方法的建立及其应用

为建立H1亚型猪流感病毒抗体检测方法,扩增了H1N1亚型猪流感病毒流行株的血凝素基因HA1部分,构建原核表达载体pET30a-HA1,并转化大肠杆菌BL21表达重组蛋白。对重组蛋白包涵体进行变性、复性和Ni-NTA亲和层析纯化。以纯化后的蛋白作包被抗原,建立间接ELISA检测方法。利用该检测方法检测了2008?2009年采集的猪血清785份,阳性率为15.54％,不同省份的阳性率存在差异 (8％~47％)。以IDEXX相关试剂盒检测结果作为参照,该方法的诊断特异性达到91％,诊断敏感性达到95％。     

H5N1亚型禽流感病毒血凝素蛋白单链抗体基因的克隆及表达

构建并表达H5N1亚型禽流感病毒血凝素蛋白单链抗体,为禽流感靶向治疗药物的研制制备靶向载体。从分泌血凝素单克隆抗体的杂交瘤细胞株中提取mRNA,采用RT-PCR法扩增出重链和轻链可变区基因,通过SOE-PCR法将重链和轻链通过Linker连接起来构建单链抗体基因,将获得的单链抗体基因装入原核表达载体pET28a(+)中,构建重组质粒并表达,以Western blot鉴定单链抗体的特异性。结果成功构建了单链抗体基因,全长714bp,经原核表达,所构建的单链抗体可与H5亚型禽流感病毒HA蛋白特异结合,为禽流感的靶向治疗奠定了基础。     

禽流感病毒H5N1亚型HA基因表达及其产物的应用

根据GenBank公布的禽流感病毒H5N1亚型血凝素基因(HA)(GenBank:DQ023145)序列设计一对引物P1、P2,以重组质粒pUC-HA为模板扩增去除信号肽的HA成熟蛋白。PCR产物克隆入pMD18-T载体,经测序发现在967位A突变为T,形成一个终止密码子TAA。在突变位点附近设计两条有21个碱基配对的突变引物P3、P4,采用重叠延伸剪切法(SOE)用A定点替换T碱基,然后将正确的基因片段定向插入到表达载体pET-32a( )中,诱导表达获得正确的表达产物。Western-blot分析表明,表达的重组蛋白能与经BL21(DE3)大肠杆菌菌体裂解液处理的H5亚型禽流感病毒阳性抗血清发生特异性反应。利用纯化的重组HA蛋白初步建立了检测H5亚型禽流感病毒抗体的间接ELISA方法,该方法可以代替传统的血凝与血凝抑制方法用于区分禽流感病毒的血清亚型。本研究为禽流感病毒亚单位疫苗及新型诊断试剂盒的研究奠定了基础。     

H5N1亚型AIVHA抗原表位的高效表达及其抗原活性分析

血凝素(hemagglutinin,HA)蛋白是禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)的一个重要表面抗原性蛋白,在疾病诊断和防治上有重要意义。本研究为了探讨一种更为简便有效的HA重组蛋白表达途径,利用生物信息学软件,对H5N1亚型AIVHA基因编码的氨基酸序列进行分析,在分析其在大肠杆菌中的密码子偏好性、稀有密码子分布情况及有关蛋白的抗原性等重要特性后,构建了HA抗原表位重组表达质粒pET-32a(+)-HA。经测试,该重组质粒在1mmol/LIPTG诱导剂作用下诱导过夜,能在大肠杆菌Rosetta-gami B(DE3)中高效表达,并得到48.1kD大小的目的重组表达蛋白。重组蛋白用6×His-tagged protein纯化试剂盒纯化后,与福氏佐剂等量混合制备成抗原,以200μg/鸡的剂量皮下注射2月龄SPF鸡3次,采血分离血清。Western-Blot试验结果表明,该重组表达蛋白能分别与所制备的高免鸡血清及H5N1亚型AIV阳性血清发生特异性反应,在硝酸纤维素膜上出现特异性杂交带。说明本试验研究的HA抗原重组表达蛋白具有良好的免疫原性和反应原性,保留了HA蛋白的抗原活性,提示该重组蛋白在H5亚型AIV的防治技术研究中具有重要的实际应用价值。     

表达H5亚型AIV血凝素的重组NDV构建及免疫原性

利用反向遗传技术获得表达H5亚型禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)的新城疫病毒(NDV)。克隆NDV clone 30的全长基因,通过在NDV的融合蛋白基因和血凝素-神经氨酸酶(HN)基因之间插入编码高致病性AIV分离株A/chicken/italy/8/98(H5N2)的血凝素基因开放阅读框从而获得两株重组新城疫病毒NDVH5和NDVH5m。NDVH5感染的细胞可以检测到两种HA转录产物。对于重组病毒NDVH5m,NDV位于HA ORF的转录终止信号序列被沉默突变消除,产生2.7个全长HA转录产物的折叠,从而使修饰过的HA得到稳定地高表达。1日龄小鸡的脑内接种证实了两种重组病毒均无致病性。鸡群在NDVH5m诱导产生的NDV和H5亚型AIV HA特异性抗体的免疫力下能够免于致死剂量的NDV与高致病性AIV的感染。血清学研究结果表明NDVH5m免疫鸡群产生的抗体可结合NP蛋白抗体的检测从而用于区分免疫和感染AIV的动物。因此,NDVH5m重组病毒可作为抗NDV和AIV的"二联疫苗",也可成为控制AJ的标记疫苗。     

应用跨膜区置换的血凝素蛋白建立H7N9禽流感病毒抗体间接ELISA检测方法

【目的】由于H7N9禽流感病毒能够感染鸡,并且已经变异成了高致病性毒株,因此,鸡群中H7N9禽流感疫苗的免疫是一个趋势,而鸡群免疫后抗体检测方法的建立也十分必要。本研究旨在建立一种灵敏、高效、高通量的鸡群H7N9亚型禽流感病毒抗体间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测方法。【方法】通过昆虫杆状病毒表达系统分别表达属于W1、W2-A和W2-B分支H7N9流感病毒的3种野生型血凝素(HA)蛋白,以及跨膜区(TM)置换为H3 HA TM的W2-B分支HA蛋白(H7-53TM)。4种HA蛋白经过离子交换层析纯化后作为抗原,通过ELISA检测H7N9禽流感病毒抗体。【结果】ELISA特异性、敏感性和重复性试验结果显示,跨膜区置换主要影响HA蛋白ELISA检测的重复性,以H7-53TM为抗原的ELISA方法具有较好的重复性,其批内和批间变异系数小于10%,然而3种野生型HA蛋白与部分血清反应批内和批间变异系数大于10%,重复性较差,因此选择H7-53TM蛋白作为ELISA包被抗原。通过受试者工作特征曲线(ROC曲线)分析,以H7-53TM为抗原的ELISA能够精准地区分H7N9亚型流感病毒抗体阳性和阴性血清。通过相关性分析,该ELISA方法与134份鸡血清HI试验结果具有显著强相关性(r=0.854 6,P0.000 1),并且与3个分支疫苗株免疫血清的HI试验结果也具有显著相关性(r0.5,P0.05)。【结论】跨膜区置换能够提高HA蛋白抗原检测H7N9禽流感病毒抗体的重复性,并应用跨膜区置换的HA蛋白建立了一种能够检测不同分支疫苗株免疫的H7N9亚型禽流感病毒抗体间接ELISA检测方法。     

禽流感病毒H9N2血凝素基因和神经氨酸酶因在大肠杆菌中的表达

克隆、表达和鉴定禽流感病毒H9N2 HA,NA基因序列,为制备抗体和基因工程疫苗打下基础。在成功克隆禽流感病毒H9N2全长HA、NA基因并测序的基础上,将部分基因序列克隆到表达载体pET32a(+)上,全基因序列克隆到表达载体pGEX4T-1上,构建了重组表达质粒pET32a(+)/HA(截短)、pET32a(+)/NA(截短)、pGEX4T-1/HA、pGEX4T-1/NA,转化大肠杆菌BL21/rosetta,IPTG诱导表达,利用Ni2+亲和层析柱和GSTrap4B亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,并用Western Blotting和ELISA方法检测其抗原性。结果重组蛋白在大肠杆菌中可以高效表达,SDS-PAGE显示其相对分子质量与预计大小一致。ELISA和Western Blotting实验证实,重组蛋白具有良好的抗原性。本研究成功克隆和表达了禽流感病毒H9N2 HA、NA基因序列。为禽流感病毒H9N2诊断试剂和疫苗的开发等进一步的研究奠定了基础。     

共表达新城疫病毒F基因和H9亚型禽流感病毒HA基因的重组鸡痘病毒

应用RT PCR扩增出新城疫病毒F4 8E8株融合蛋白 (F)基因 ,将其克隆入pGEM Teasyvector构建重组质粒pGEM TF并进行测序确证。分别从pGEM T和pUCHA切下F基因和H9亚型禽流感病毒F株 (A chicken china F 1 998)血凝素 (HA)基因 ,通过一系列分子生物学操作步骤插入到质粒pFPV7S中的鸡痘病毒基因组复制非必需片段构建重组质粒p7SHF ,其中F基因和HA基因分别由鸡痘病毒启动子PE L和合成启动子PS调控。最后将P1 1 LacZ报告基因表达盒插入质粒p7SHF获得转移载体pFPVHF ,用以转染已预先感染鸡痘病毒 2 82E4疫苗株的鸡胚成纤维细胞 (CEF)。通过在含有X Gal的营养琼脂上连续挑选蓝色病毒蚀斑获得并纯化重组病毒。PCR和Southernblot检测证实了F基因和HA基因已插入鸡痘病毒的基因组 ;间接免疫荧光试验结果表明重组病毒能够同时正确表达HA和F蛋白。     

抗H9亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体的制备和鉴定

目的:获得分泌抗H9亚型禽流感病毒(AIV)血凝素单克隆抗体的杂交瘤细胞。方法:以H9N2亚型AIV为免疫原,免疫6～8周龄雌性BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0-Ag-14,在PEG4000的作用下进行细胞融合,通过血凝抑制(HI)试验筛选分泌抗H9亚型AIV血凝素单克隆抗体的杂交瘤细胞。结果:经过连续3～4次克隆化,获得能稳定分泌抗H9亚型AIV血凝素的单克隆抗体细胞系6株,分别命名为1B2、1C10、1G2、2B7、2E3和5E11。6株细胞培养上清HI效价为24～28,腹水HI效价为210～213。除1G2为IgM外,其余5株均为IgG1。Western blotting结果显示,1B2、1C10、2B7和2E3能与AIVH9蛋白在Mr为75000处反应,表明其是针对AIVH9亚型血凝素蛋白的单抗。特异性试验表明该6株单抗均只与H9亚型AIV发生特异性HI反应,而不与其他14个HA亚型的AIV及新城疫病毒、传染性支气管炎病毒发生交叉反应,显示出良好的特异性。结论:制备了针对H9亚型禽流感病毒血凝素的单克隆抗体,为禽流感的快速诊断和病毒的抗原性分析等奠定了基础。     

IBV核蛋白的表达纯化及在监测中应用

鸡传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）是禽类一种变异性很强的冠状病毒,为获得高度纯化的IBV核蛋白,建立监测IBV抗体的方法,通过RT-PCR从IBV中扩增IBV-N基因,定向连接到表达载体pGEX-KG中,转化E. coli BL21（DE3）菌株,诱导获得表达产物,SDS-PAGE分析产物大小、Western blot分析其免疫学活性,通过亲和层析法获得高度纯化的表达蛋白,建立一种检测IBV抗体的方法,并应用于临床监测。结果显示,IBV-N基因全长1230bp,GST融合蛋白表达产物大小约为80kDa,表达量约占菌体总蛋白的25%,具有良好的免疫学活性;通过GST亲和层析柱成功获得纯化蛋白,以该蛋白包被酶标板,成功地建立了一种检测血清中IBV抗体的间接ELISA方法。研究表明重组N蛋白作为IBV诊断抗原,具有制备简便、特异性强、敏感性高、重复性好的特点,可用于该病的临床监测,为该病疫情监测、发病机制研究奠定了基础。