利用反向遗传学技术构建H5亚型禽流感高产疫苗株

采用RT-PCR技术分别扩增了鹅源高产禽流感病毒的6条内部基因片段,近期分离的H5N1亚型禽流感病毒的血凝素基因以及N3亚型参考毒株的神经氨酸酶基因,分别构建了8个基因的转录与表达载体,利用反向遗传学技术拯救出了全部基因都源于禽源的重组流感病毒疫苗株rH5N3。通过对血凝素蛋白HA1和HA2连接肽处的5个碱性氨基酸(R-R-R-K-K)基因缺失与修饰,从而消除了病毒基因的毒力相关序列,拯救的rH5N3疫苗株对鸡和鸡胚均无致病性,病毒在鸡胚尿囊液和细胞培养上清的HA效价得到极大提高,分别为12048和1512。制备的禽流感疫苗免疫动物后4~5周即可诱导产生高效价的HI抗体,鸡免疫后18周依然保持高水平的HI抗体。重组疫苗不论是对于国内早期分离的禽流感病毒A/Goose/Guangdong/1/96还是近期分离的A/Goose/HLJ/QFY/04都能够产生完全的免疫保护作用,免疫鸡攻毒后不发病、不排毒、不死亡。带有N3鉴别诊断标记禽流感疫苗株的研制为H5N1高致病性禽流感的防治提供了新的技术保障。     

H3N2亚型猪流感病毒的拯救及HA与NA基因的替换

摘要：【目的】为研究流感病毒突破种间屏障分子机制,筛选流感基因工程疫苗株。【方法】本实验以猪流感病毒A/Swine/Henan/S4/01(H3N2)为亲本株,利用反向遗传学操作技术,采用RT-PCR技术对该病毒的8个基因片段分段进行扩增,通过与双向转录载体pHW2000连接, 重组质粒转染293T和MDCK共培养细胞,拯救出全部基因均来自于亲本株的猪流感病毒rgH3N2,并分别以人流感病毒A/ PR/8/34(H1N1)、禽流感病毒A/Duck/Nanchang /4-165/2000 (H4N6 )、马流感病毒A/Equine/Fuyun/2008/(H3N8)的HA和NA基因替换A/Swine/Henan/S4/01的相应基因,【结果】生物学实验结果表明rgH3N2在鸡胚半数感染量、组织培养半数感染量、稳定性试验等方面都与亲本株保持一致。rgH3N2经鸡胚多次传代后血凝价最高可达到1:256,接种MDCK细胞60 h后,血凝价可以达到1:64。基因替换后成功拯救出的重组病毒rgH1N1、rgH4N6和rgH3N8在鸡胚和细胞上均具有较高的增殖能力。【结论】病毒的成功拯救为流感病毒突破种间屏障分子机制,HA、NA基因在流感病毒跨种属传播中所扮演角色的研究和流感基因工程疫苗株的筛选奠定了基础。     

H5N1禽流感病毒HA基因在昆虫细胞中的表达及生物活性鉴定

经RT-PCR扩增了H5N1亚型禽流感病毒血凝素基因(HA)片断,限制性内切酶酶切后将其克隆到pFastBacHTA杆状病毒转座载体,经酶切鉴定及测序,筛选出阳性重组转座载体pFastBac-H5。将pFastBacH5转化含有杆状病毒穿梭载体（bacmid）的DH10Bac感受态细胞,通过蓝白斑筛选和PCR鉴定获得重组杆状病毒穿梭载体rBacmid-H5。rBacmid-H5在脂质体介导下转染sf9昆虫细胞,SDS－PAGE蛋白电泳、Western blot、血凝试验和血凝抑制试验分析表明：分子量约63Kd重组血凝素蛋白（rH5）在sf9昆虫细胞中实现了高效表达。rH5具有血凝活性,而且其血凝活性能够被H5N1禽流感病毒高免血清所抑制;rH5免疫鸡诱导产生针对H5N1禽流感病毒亚型特异的血凝抑制抗体,说明表达的重组蛋白具有与天然蛋白相似的生物活性。     

H1亚型猪流感病毒血凝素基因在昆虫细胞中的表达及其间接ELISA方法的初步建立

根据GenBank发表的H1亚型猪流感HA基因序列设计引物,扩增出HA基因片段.将其克隆到pFastBacGP67B杆状病毒载体上,筛选阳性重组转座载体pFastBacGP67B-H1,转化含有杆状病毒穿梭载体(bacmid)的DH10Bac感受态细胞,构建杆状病毒表达载体获得重组转座子(rBacmid-H1),在脂质体介导下转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒(rBV-H1),再感染细胞,收获目的蛋白.通过血凝试验、免疫印迹法、免疫组化分析表明该蛋白得到表达,且具有良好的生物学活性.利用表达的蛋白作为猪流感间接ELISA的抗原,初步建立H1亚型猪流感的间接ELISA检测方法,并对内蒙古、辽宁和黑龙江等地送检的93份猪血清进行了检测,阳性率为31.18%,为研制开发快速、准确、简便的H1亚型猪流感鉴别诊断试剂盒奠定基础.     

H5N1亚型禽流感病毒NS1基因在昆虫细胞中的表达

将H5N1亚型禽流感病毒（AIV）NS1基因插入到杆状病毒转移载体pFastBac1中,获得重组转移载体pFastBac1- NS1。将pFastBac1- NS1转化到DH10Bac感受态细胞中,筛选到重组转座子rBacmid-NS1。在脂质体转染试剂介导下将rBacmid-NS1转染对数生长期的Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒rBV-NS1。rBV-NS1感染Sf9细胞后,通过SDS-PAGE、Western blot和ELISA分析表明：获得了分子量为26ku的特异性NS1蛋白;并且该蛋白可与H5N1 AIV攻毒鸭的血清发生特异性免疫反应,而不能与H5N1AIV灭活疫苗免疫鸭的血清发生反应。试验结果表明：NS1在Sf9昆虫细胞中获得了高效表达,具有与天然蛋白相似的免疫活性,并可以作为区分免疫及自然感染个体的鉴别诊断抗原。本实验为建立禽流感病毒自然感染家禽与禽流感灭活苗免疫家禽的鉴别诊断方法奠定基础。     

重组细胞高产型H3N2猪流感病毒株的拯救

为拯救出一株能够在动物传代细胞中高水平复制的H3N2亚型猪流感疫苗株,利用反向遗传操作技术,将A/Goose/Dalian/3/01(H9N2)毒株的PB1、PA、NP、M、NS基因和A/PR/8/34毒株的PB2基因作为内部基因与猪流感病毒A/Swine/Henan/S4/01(H3N2)毒株的HA、NA基因进行重组,成功拯救出了具有高度细胞适应性毒株rH3N2株,该毒株接毒MDCK细胞60h后,血凝价可以达到1∶512,表明该毒株具有高度适应细胞繁殖特性,为H3N2亚型猪流感病毒细胞培养型疫苗的研制奠定了基础。     

H1N1亚型猪流感病毒广东分离株全基因克隆及其遗传演化分析

为了研究H1N1亚型SIV遗传演化与变异的特性,采用RT-PCR技术分别扩增A/Swine/Guangdong/LM/2004(H1N1)的8个基因片段,分别将其克隆到pMD18-T载体,进行全基因组序列测定.核苷酸序列测定结果显示:LM株SIV各基因片段均未发现核苷酸插入或缺失现象.HA切割位点处的氨基酸序列序列为IPSIQSR↓G,与高致病性SIV的H1N1亚型毒株的分子特征不符合.HA基因含有6个潜在的N-糖基化位点,4个在HAl的第11、23、87、和276位,增加2个分别在HA2的154和213位点;NA基因不仅在58、63、68、88和146位含有高度保守的N-糖基化位点,而且在44和235位增加2个潜在的N-糖基化位点,这可能是近期H1N1亚型SIV的一个分子特征.核苷酸同源性结果:HA基因与类人谱系的流感病毒分离株有很高的同源性(99%),而其他基因均与古典猪谱系的流感病毒分离株同源性较高(87%～98%).从绘制的各个片段进化树和核苷酸同源性分析结果,可以推测该毒株HA基因可能来源于类人谱系的流感病毒;而其他基因来源于古典猪谱系的流感病毒.     

H1亚型猪流感病毒HA基因DNA疫苗的构建及其对Balb/c小鼠的免疫效果评价

以A/Swine/Guangdong/LM/2004(H1N1)猪流感病毒HA基因为模板,通过RT-PCR技术扩增出HA基因,并将其克隆到pCI-neo真核表达载体中,成功构建重组表达质粒pCI-HA,瞬时转染vero E6和293T细胞,通过免疫过氧化物酶单层细胞试验(Immunoperoxidase monolayer assay ,IPMA)、间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay, iIFA)和蛋白免疫印迹（Western blot,WB）实验证明,HA基因能够在哺乳动物细胞中有效表达并具有良好的生物学活性。将重组质粒三次免疫8w雌性Balb/c小鼠后,ELISA试验和中和试验结果表明该重组质粒能够诱导小鼠产生较高的抗体滴度,并具有良好的中和活性。因此为H1亚型猪流感DNA疫苗的研究奠定了理论基础。     

比较不同血清型AAV携带HBV基因组建立乙肝小鼠模型效果

近年来,用8型腺相关病毒携带1.3拷贝HBV(Hepatitis B virus)基因组建立的HBV持续感染小鼠模型受到越来越多的关注。本研究比较了除AAV8之外的其他4种血清型重组腺相关病毒(Recombinant adeno-associated virus,rAAV)建立乙肝小鼠模型效果。首先,将携带1.3拷贝ayw亚型HBV基因组的1型、2型、5型、8型、9型腺相关病毒分别以1×10~(11) vg/只(Viral genome,vg)的剂量尾静脉注射C57BL/6J小鼠;利用ELISA方法监测小鼠血清中HBeAg和HBsAg表达水平;用定量PCR方法检测小鼠血清和肝脏中HBV DNA拷贝数;用免疫组化方法检测小鼠肝脏中HBc Ag的表达;用HE染色检测小鼠肝脏病理变化。结果显示,在持续8周中,5组小鼠血清中都检测到HBeAg和HBsAg的表达,血清和肝脏中均检测到HBV DNA的存在。HBeAg、HBsAg、HBV DNA表达水平高低依次为AAV8AAV9AAV1AAV5AAV2。5组小鼠用免疫组化方法都检测到肝脏中HBcAg表达,HE染色病理检测均观察到不同程度的肝损伤。本研究扩大了能用于建立乙肝小鼠持续感染模型可选择的AAV载体种类,发现虽然AAV1、2、5、9的建模效果不如AAV8,但它们都可以介导建立持续感染的乙肝小鼠模型,建模效果依次为AAV8AAV9AAV1AAV5AAV2。其中AAV9介导的建模效果与AAV8载体最为接近,可以替代AAV8载体用于有效地建立HBV持续感染的小鼠模型。     

一株鹅源H5N2亚型高致病性禽流感病毒的分离鉴定及生物学特性分析

分离到一株鹅源 H5N2亚型高致病性禽流感病毒,SPF鸡静脉接种致病指数为2.99,但鸭子对该病毒不敏感．病毒感染小鼠后不致病,但能够在肺内有效复制,表明其具有感染哺乳动物的潜在风险．血凝素(hemagglutinin, HA)蛋白裂解位点上插入有多个连续的碱性氨基酸(-RRRKKR-),从分子上证实这是一株高致病性禽流感病毒．核酸序列比较分析表明,分离的流感病毒HA基因与A/chicken/Hubei/489/2004 (H5N1)同源率达到99.4%,神经氨酸酶(neuraminidase, NA)基因与A/chicken/Jilin/53/01(H9N2)同源率达到99.8%;氨基酸水平上,HA与2004年分离到的A/chicken/Hubei/489/2004(H5N1)、A/swan/Guangxi/307/2004(H5N1)、A/wildduck/Guangdong/314/　2004(H5N1)和A/chicken/Henan/210/2004(H5N1)同源率均为99.3%,NA 与A/chicken/Jilin/53/01(H9N2)同源率为99.6%．进化树分析结果表明,该流感病毒分离株可能是由H5N1和H9N2两个亚型病毒重排而来．