H5N1亚型禽流感病毒NS1基因截短体的克隆与原核表达

禽流感病毒H5N1 NS1蛋白是一种非结构蛋白,在病毒感染过程中发挥着重要的作用.构建基因截短的重组蛋白,可为进一步研究NS1不同结构域与宿主蛋白间的相互作用奠定基础.在成功克隆禽流感病毒H5N1全长NS1基因并测序的基础上,将部分截短基因序列克隆到表达栽体pET28a(+)上,构建基因截短的重组表达质粒pET28a-NS1-RBD和pET28a-NS1-ED,转化大肠埃希菌BL21(DE3),阳性重组质粒经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE检测,获得预期蛋白的表达,然后利用Ni-NTA树脂蛋白纯化系统对重组蛋白进行纯化,并通过Western Blotting进一步确认NS1及截短体蛋白的表达.结果表明,实验成功构建禽流感病毒H5N1亚型的NS1蛋白截短体,并在大肠埃希菌中高效表达,这为进一步研究NS1蛋白不同结构域与宿主蛋白的相互作用提供了实验材料,为深入研究NS1蛋白的生物学功能奠定了坚实基础.     

H5N1亚型高致病性禽流感病毒NS1基因的克隆及其序列分析

目的：克隆H5N1亚型禽流感病毒的NS1基因,并分析其序列特性。方法：通过RT-PCR方法克隆H5N1亚型禽流感病毒NS1基因,并对该基因片段进行测序,将此序列与数据库中不同时间、地点、宿主来源的H5N1亚型流感毒株NS1基因序列进行同源性比较。结果：获得了678bp的NS1全长基因,可编码225个氨基酸;其与毒株A／chicken／Jilin／hq／2003的同源性最高,二者的核酸和氨基酸的同源性分别为99．7％和99．1％。比对分析发现,该毒株NS1基因在第238-252位有15个核苷酸的缺失;进化树分析表明,它与1997年香港流行的H5N1亚型禽流感病毒毒株分别属于2个不同的分支。结论：克隆了一株H5N1亚型禽流感病毒的NS1基因,并初步分析了其序列特性,为进一步研究NS1基因的功能奠定了基础。     

禽流感病毒分离株NS基因同源性及等位基因类型分析

目的　克隆测定国内具有代表性的禽流感病毒 (AIV)的非结构 (NS)蛋白基因核苷酸序列 ,分析其同源性和等位基因类型 ,为进一步探索禽流感NS蛋白抗体监测方法奠定基础。方法　经RT PCR扩增了国内 3株H9N2、2株H5N1、2株H7N2亚型AIV分离株的NS蛋白基因 ,并把扩增的基因片段克隆到pGEM T载体中测序 ,将测序结果与GenBank中的核苷酸序列进行同源性比较 ,绘制基因进化树。结果　经测序获得了各AIV分离株NS基因的完整编码序列。同源性分析表明 ,3株H9亚型AIV的NS基因之间的同源性为 96 %～ 98% ;两株H5亚型AIVNS基因同源性为 91 6 % ;两株H7亚型AIV的NS基因同源性为 98 9%。H5和H9亚型分离株的NS基因之间的同源性均高于 90 % ;而H7N2亚型分离株与其它两种亚型分离株的NS基因同源性约为 6 0 %～ 70 %。在AIVNS基因系统发育进化树中 ,H5、H9亚型分离株都处于等位基因A群内 ;3株H9亚型分离株的进化关系较近 ,与香港、广东的部分H5N1病毒株起源相同 ,而 2株H5病毒的NS基因则处于不同分枝内 ;2株H7亚型分离株的NS基因都处于等位基因B群内 ,进化关系较近。结论　这 7株国内AIV分离株的NS基因之间的同源性差异较大 ,约为 6 0 %～ 99% ,且包括A、B两种类型的等位基因     

禽流感病毒H9N2血凝素基因和神经氨酸酶因在大肠杆菌中的表达

克隆、表达和鉴定禽流感病毒H9N2 HA,NA基因序列,为制备抗体和基因工程疫苗打下基础。在成功克隆禽流感病毒H9N2全长HA、NA基因并测序的基础上,将部分基因序列克隆到表达载体pET32a(+)上,全基因序列克隆到表达载体pGEX4T-1上,构建了重组表达质粒pET32a(+)/HA(截短)、pET32a(+)/NA(截短)、pGEX4T-1/HA、pGEX4T-1/NA,转化大肠杆菌BL21/rosetta,IPTG诱导表达,利用Ni2+亲和层析柱和GSTrap4B亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,并用Western Blotting和ELISA方法检测其抗原性。结果重组蛋白在大肠杆菌中可以高效表达,SDS-PAGE显示其相对分子质量与预计大小一致。ELISA和Western Blotting实验证实,重组蛋白具有良好的抗原性。本研究成功克隆和表达了禽流感病毒H9N2 HA、NA基因序列。为禽流感病毒H9N2诊断试剂和疫苗的开发等进一步的研究奠定了基础。     

H5N1亚型禽流感病毒NS1基因的克隆及其诱导肺腺癌细胞A549凋亡的研究

通过RT-PCR的方法克隆H5N1亚型禽流感病毒NS1基因,并构建了真核表达载体pCMV-Myc/NS1。将此真核表达质粒转染肺腺癌细胞A549,48 h后,经Western印迹检测,NS1基因能在细胞中正确表达。经荧光显微镜、透射电镜观察和流式细胞仪检测,发现该株流感病毒的NS1蛋白可诱导肺腺癌细胞A549凋亡。     

禽流感病毒H5N1亚型NS1基因在大肠杆菌中的表达

目的表达H5N1亚型禽流感病毒(AIV)NS1蛋白,用于AIV感染与注射灭活疫苗鸡的鉴别诊断和NS1蛋白功能研究。方法采用RT_PCR方法对H5N1亚型AIVNS1基因进行扩增,将PCR产物克隆于pGEM_T_easy载体,将该基因插入pGEX_4T_1中构建NS1基因原核表达载体,转化BL21大肠杆菌后,在IPTG诱导下表达NS1蛋白,Westernblot鉴定表达NS1蛋白。结果成功克隆H5N1亚型AIV的NS1基因,其核苷酸序列长度为690bp,编码230个氨基酸残基。构建NS1基因原核表达载体在大肠杆菌内表达出约51×103的NS1融合蛋白。Westernblot鉴定表明表达NS1蛋白与H7N2AIV感染鸡血清有反应性。结论在大肠杆菌中成功表达了H5N1亚型AIVNS1基因蛋白,具有与感染H7N2亚型AIV阳性血清反应原性。     

华南流感病毒NS1基因特性研究

为了解H9N2和H5N1亚型流行性感冒病毒株的NS1基因特性,采用RT-PCR方法测定了12株2000～2003年间在华南地区分离的禽流感病毒株的NS1基因核苷酸序列. 测序显示6株H9N2亚型流感病毒NS1基因开放阅读框(ORF)长654 bp,编码217个氨基酸. 6株H5N1亚型毒株NS1基因ORF长678 bp,编码225个氨基酸. 核苷酸和氨基酸同源性分析表明,同一亚型分离株之间有很高的同源性,而不同亚型的H9N2和H5N1毒株之间存在较大差异. BLAST分析表明,H5N1和H9N2亚型流感病毒分离株的NS1基因分别与近两年从香港特区和华南地区的鸭中分离的毒株A/Duck/Hong Kong/646.3/01 (H5N1)、A/Duck/Shantou/2143/01 (H9N2)有很高的亲缘关系. 该研究结果为进一步进行NS1功能研究奠定了基础.     

禽流感病毒H5N1血凝素基因和神经氨酸酶基因在大肠杆菌中的表达

目的：克隆、表达和鉴定禽流感病毒H5N1血凝素基因（hemagglutinin,HA）和神经氨酸酶基因（neuramidinase,NA）序列,为制备抗体和基因工程疫苗打下基础。方法：在成功克隆禽流感病毒H5N1全长HA、NA基因并测序的基础上,将部分基因序列克隆到表达载体pET32a（＋）上,全基因序列克隆到表达载体pGEX4T-1上,构建了重组表达质粒pET32a（＋）/HA(49~1587bp)、pET32a（＋）/NA(121~1141bp)、pGEX4T-1/HA、pGEX4T-1/NA,转化大肠杆菌BL21/rosetta,IPTG诱导表达,利用Ni2＋亲和层析柱和GSTra P4B亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,并用Western blotting和ELISA方法检测其抗原性。结果：重组蛋白在大肠杆菌中可以高效达,SDS PAGE显示其相对分子质量与预计大小一致,蛋白纯度占总蛋白的90％以上。ELISA和Western blotting实验证实,重组蛋白具有良好的抗原性。结论:成功克隆和表达了禽流感病毒H5N1 HA、NA基因序列,为禽流感病毒H5N1诊断试剂和疫苗的开发等进一步的研究奠定了基础。     

A型流感病毒NS1蛋白羧基端PL结构域影响NS1在细胞核内的定位

A型流感病毒NS1蛋白羧基端4个氨基酸可以与PDZ结构域(the domain of PSD95,Dig and ZO-1)相结合,称为PL结构域(PDZ ligand domain)．对不同亚型或毒株的流感病毒而言,其NS1蛋白PL结构域的组成存在比较大的差异．有研究发现这种差异能够影响NS1与宿主细胞蛋白的相互作用进而影响病毒的致病力．为进一步探讨PL结构域对NS1蛋白生物学特性的影响,首先构建出4种不同亚型流感病毒(H1N1、H3N2、H5N1、H9N2)来源的NS1绿色荧光蛋白表达质粒．在此基础上,对野生型H3N2病毒NS1表达质粒进行人工改造,将其PL结构域缺失或者替换为其他亚型流感病毒的PL结构域,制备出4种重组NS1蛋白表达质粒．通过比较上述不同NS1蛋白在HeLa细胞中的定位情况发现,只有野生型H3N2病毒的NS1蛋白可以定位于核仁当中,而野生型H1N1、H5N1、H9N2病毒的NS1蛋白以及PL结构域缺失或替代的H3N2病毒NS1蛋白都不能定位于核仁．而通过比较上述NS1蛋白在流感病毒易感的MDCK细胞中的定位,进一步发现所有这些蛋白均不定位于核仁．上述结果表明：PL结构域的不同可以明显影响NS1蛋白在HeLa细胞核内的定位和分布,这有可能造成其生物学功能的差异．同时,NS1蛋白在细胞核内的定位还与宿主细胞的来源有着密切关系．     

一株H3N2亚型猪流感病毒广东分离株的基因组序列分析

从广东省疑似流感发病猪分离到1株H3N2亚型猪流感病毒(A/Swine/Guangdong/01/2005(H3N2)),对其各个基因进行克隆与测序,并与GenBank中收录的其它猪流感、禽流感和人流感的相关基因进行比较,结果表明,HA全基因与广东2003~2004年分离的H3N2猪流感毒株的核苷酸序列同源性在99%以上,与纽约90年代末分离的H3N2人流感毒株同源性在98.5%以上;NA基因与纽约1998~2000年分离的H3N2人流感毒株的核苷酸序列同源性在99%以上;NS基因、M基因的核苷酸序列与H1N1亚型猪流感毒株A/swine/HongKong/273/1994(H1N1)的核苷酸序列同源性较高,分别为97.9%、98.4%,与美洲A/swine/Iowa/17672/1988(H1N1)的核苷酸序列同源性分别为96.7%、97.1%;其他基因的核苷酸序列与H3N2人流感毒株具有很高的同源性。因此,推测其M和NS基因来源于H1N1亚型猪流感病毒,HA、NA及其他基因均来源于H3N2亚型人流感病毒。表明此H3N2亚型猪流感病毒为H3N2亚型人流感病毒和H1N1亚型猪流感病毒经基因重排而得到的重组病毒。     

H5N1禽流感病毒环介导等温扩增快速检测方法的建立

目的：建立H5N1禽流感病毒环介导等温扩增（LAMP）快速检测方法。方法：从GenBank中获得H5N1禽流感病毒血凝素（HA）基因序列,应用DNAStar软件MegAlign程序分析其序列,利用PrimerExplorerV3软件在序列保守区域设计LAMP引物,即外引物、内引物和环引物,同时以所克隆的阳性质粒为模板,对试验中的几个重要参数进行优化。结果：LAMP检测方法对H5N1禽流感病毒的灵敏度达到4～6个拷贝,其引物对于H1、H9亚型禽流感病毒和新城疫病毒无非特异性扩增,表现出良好的H5亚型特异性。结论：建立的H5N1禽流感病毒环介导等温扩增快速检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,为快速检测禽流感病毒提供了新方法和新思路。     

A Single Amino Acid Substitution in the Novel H7N9 Influenza A Virus NS1 Protein Increases CPSF30 Binding and Virulence

Although an effective interferon antagonist in human and avian cells, the novel H7N9 influenza virus NS1 protein is defective at inhibiting CPSF30. An I106M substitution in H7N9 NS1 can restore CPSF30 binding together with the ability to block host gene expression. Furthermore, a recombinant virus expressing H7N9 NS1-I106M replicates to higher titers in vivo, and is subtly more virulent, than the parental virus. Natural polymorphisms in H7N9 NS1 that enhance CPSF30 binding may be cause for concern.     

Avian and 1918 Spanish influenza a virus NS1 proteins bind to Crk/CrkL Src homology 3 domains to activate host cell signaling

NS1 (nonstructural protein 1) is an important virulence factor of the influenza A virus. We observed that NS1 proteins of the 1918 pandemic virus (A/Brevig Mission/1/18) and many avian influenza A viruses contain a consensus Src homology 3 (SH3) domain-binding motif. Screening of a comprehensive human SH3 phage library revealed the N-terminal SH3 of Crk and CrkL as the preferred binding partners. Studies with recombinant proteins confirmed avid binding of NS1 proteins of the 1918 virus and a representative avian H7N3 strain to Crk/CrkL SH3 but not to other SH3 domains tested, including p85alpha and p85beta. Endogenous CrkL readily co-precipitated NS1 from cells infected with the H7N3 virus. In transfected cells association with CrkL was observed for NS1 of the 1918 and H7N3 viruses but not A/Udorn/72 or A/WSN/33 NS1 lacking this sequence motif. SH3 binding was dispensable for suppression of interferon-induced gene expression by NS1 but was associated with enhanced phosphatidylinositol 3-kinase signaling, as evidenced by increased Akt phosphorylation. Thus, the Spanish Flu virus resembles avian influenza A viruses in its ability to recruit Crk/CrkL to modulate host cell signaling.     

人感染H7亚型禽流感事件

本研究综述了自1959年以来国内外发生的人感染H7亚型禽流感事件。大多数是在家禽爆发禽流感期间,农场工人在处置感染鸡群过程中被暴露而感染;也有曾接触活禽或曾到过活禽市场而感染;有经禽流感病毒致病的哺乳动物（海豹）感染于人或实验室感染（事故）所致。引起人感染的H7亚型中已知有H7N2、H7N3、H7N7以及2013年在中国发现的新的致病亚型H7N9。H7N2、H7N3、H7N7感染以结膜炎为主,大多为轻症;而H7N9感染以严重的呼吸道感染为特征,表现为重症肺炎,呼吸窘迫综合症,病死率高达33.6%。