H9N2禽流感病毒反向遗传系统转录／表达载体的构建和验证

设计带有BsmBI、BsaI或AarI酶切位点的引物,用RT-PCR扩增H9N2亚型禽流感病毒(AIV)的8个基因全长片段,克隆入双向转录/表达载体pHW2000,并在PB2、PB1和NA基因中共引入了3个沉默突变标签。将其2个表面基因(HA和NA基因)加上任意1个内部基因,而其它5个内部基因来自A/WSN/33,进行了6种3 5组合形式的基因重排,把相应组合的转录/表达质粒共转染COS-1细胞,均产生了预期组合、有感染性的H9N2亚型流感病毒,表明亲缘关系遥远的流感病毒可以互相获取基因片段产生重组病毒,提示表面结构基因和单个内部基因不足以限制H9N2AIV在哺乳动物细胞上的宿主范围,同时也验证了构建的8个转录/表达载体均能有效工作,为进一步研究H9N2亚型AIV基因结构与功能、AIV与宿主之间的关系打下了基础。     

不同EGF和胰岛素水平对体外培养的大熊猫皮肤成纤维细胞的影响

用DME∶Ham sF12(1∶1)培养液,添加3个水平的EGF和2个水平的胰岛素,组合成6种培养体系(CS)分别培养大熊猫皮肤成纤维细胞。通过对细胞生长速度和染色体数目变异率进行测定,测得在添加10μg/ml的胰岛素和40 ng/ml的表皮生长因子的培养体系中,以1.673±0.185×105/ml密度接种细胞,经3.5天,密度达到6.890×105/ml,其生长速度最快;染色体数目为二倍体的百分率为75.77%。综合衡量,CS-5在本研究中更适合大熊猫皮肤成纤维细胞的培养。     

HS-SPME-GC / MS 在大熊猫尿液化学成分检测中的应用

尿液在大熊猫化学通讯过程中具有重要作用。对大熊猫尿液中化学成分的检测是揭示大熊猫尿液中化学物质组成及其功能的关键。本实验通过使用顶空固相微萃取技术(Headspace-solid phase microextraction,HSSPME)对大熊猫尿液样品进行前期处理,继而利用气相色谱- 质谱联用技术(Gas chromatography-mass spectrometry,GC / MS)对大熊猫尿液中化学成分进行检测。共检测到56 个峰,通过在NIST (National Institute of Standards
and Technology)质谱库中进行检索,初步推定出其中的38 种物质。除此之外,还对HS - SPME 萃取头的净化方法进行了探索和改进。结果表明,顶空固相微萃取技术结合气相色谱- 质谱联用技术能够应用于大熊猫尿液中挥发性与半挥发性化合物的检测,并且能够得到较好的实验结果,为揭示大熊猫化学通讯机理提供基础。     

大熊猫皮肤成纤维细胞系的建立和冷冻保存

简要介绍了大熊猫（Ailuropoda melanoleuca）皮肤成纤维细胞的建系过程和冷冻保存。在研究中,采用200IU／ml的胶原蛋白酶Ⅰ酶在4℃下解离皮肤组织。在DME／Ham’sF12和M199两种培养液中添加100Iu,ml青链霉素、5pg,ml两性霉素B、5pg／ml M-Plasmocin^TM、2mmol／L L-Glu、10μg/ml的胰岛素、40ng/ml EGF和20％（原代）或10％（传代）FBS组成培养液,分别用于细胞的贴壁培养和植块培养,均获得培养成功。用PBS添加0．4％BSA、0．1mol／L蔗糖和10％DMSO组成的冷冻保存液对细胞进行冷冻保存,解冻后获得93．258％的活率,解冻细胞再次培养能正常生长。研究结果表明,大熊猫皮肤成纤维细胞建系和冷冻保存获得成功。     

己酮可可碱在哺乳动物辅助生殖技术方面的应用进展

综述了己酮可可碱在哺乳动物辅助生殖技术方面的应用情况.概括了己酮可可碱在精子细胞浆内注射、人工授精、体外处理精液和口服使用对生殖细胞的改善作用等方面的应用情况,最后概述了己酮可可碱对生殖细胞可能生生的毒性作用.     

雄性大熊猫褪黑素与睾酮季节性变化

褪黑素通过调控下丘脑-垂体-性腺内分泌轴使季节性繁殖动物在适宜的季节进行繁殖活动.大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)在春季集中繁殖.为探究雄性大熊猫褪黑素和睾酮的季节性变化规律,本研究选取成都大熊猫繁育研究基地3只成年雄性大熊猫作为实验对象,在自然光照下对这3只大熊猫进行每周1次为期1年(2018年...     

表达鸡白细胞介素2重组鸡痘病毒的构建及其体外表达产物生物活性的检测

从ConA刺激的鸡脾细胞中扩增出鸡白细胞介素2（ChIL-2）基因编码区。将该编码区Cdna序列和调控其转录的鸡痘病毒早晚期启动子（PE/L）的基因片段定向克隆到鸡痘病毒转移载体p1175中,获得重组转移载体P1175il2,然后转染已感染鸡痘病毒282E4疫苗株（wt-FPV）的鸡胚成纤维细胞（CEF）,质粒P1175il2与wt-FPV基因组DNA发生同源重组,产生了表达ChIL-2的重组鸡痘病毒Rfpv-IL2。通过在含X-gal的营养琼脂上连续挑选蓝色病毒蚀斑,获得并纯化重组鸡痘病毒Rfpv-IL2。应用XTT/PMS方法检测的Rfpv-IL2 （M.O.I 2.0）感染CEF 72小时后细胞上清中表达的重组ChIL-2生物活性,效价为3.6×105u/Ml,表明Rfpv-IL2能有效地表达ChIL-2。下一步将利用Rfpv-IL2在体内表达ChIL-2,研究ChIL-2的免疫增强作用及其作用机理。     

苜蓿叶片水杨酸含量与其蓟马抗性的关系

采用不同抗蓟马特性的苜蓿品系,于不同蓟马虫口密度下测定苜蓿水杨酸含量和虫害程度,以明确苜蓿叶片水杨酸含量与其抗蓟马特性的关系.结果表明,苜蓿叶片游离态、结合态水杨酸含量均与苜蓿抗蓟马特性密切相关;高抗品系(抗蓟马品系)的水杨酸初始含量(0.539 mg·g-1)高于低抗品系(0.403 mg·g-1);与较低抗品系相比,高抗品系受害器官(叶)水杨酸含量随虫口密度和危害点面积的增大而增加相对缓慢,而随危害指数的增大而增加较快(3.84倍).可见,水杨酸主要是间接增强苜蓿对蓟马的抗性;高抗蓟马苜蓿品系能通过快速获得较高水杨酸含量来阻碍被危害伤口的扩大,降低其受危害程度,促使自身产量和品质提高.     

用反向遗传操作技术产生致弱的H5亚型重组流感病毒

选择一株鹅源H5N1亚型禽流感病毒 (AIV) ,缺失其HA基因裂解序列的 4个碱性氨基酸、使HA裂解模式由高致病性的PQRERRRKKR↓GL突变为低致病性的PQRESR↓GL ,将修饰的HA基因克隆入转录 表达载体pHW2 0 0 0、构建质粒pHW5 2 4_HA ,将该毒株和H9N2亚型毒株的NA全基因分别克隆入pHW2 0 0 0 ,构建质粒pHW5 0 6_NA和pHW2 0 6_NA。将pHW5 2 4_HA与pHW5 0 6_NA或pHW2 0 6_NA组合、均用A WSN 33(H1N1)提供 6个内部基因 ,两个组合的 8个质粒分别共转染COS_1细胞 ,产生了H5N1和H5N2两个亚型的基因重排病毒。通过在鸡胚中的连续传代和适应 ,2个重组病毒血凝价上升到 1∶2 9、表面基因稳定、对 6周龄SPF鸡不表现致病性 ,H5N2重组病毒对鸡胚的毒力低于H5N1病毒。这种尝试证明反向遗传操作技术是研究AIV致病性和构建疫苗候选株的有用工具     

鹅源新城疫病毒ZJ1株微型基因组的构建及其初步应用

在获得鹅源新城疫病毒ZJ1株全基因组序列的基础上,用增强型绿色荧光蛋白（eGFP）报告基因取代鹅源新城疫病毒ZJ1株整个编码区,只保留与病毒复制、转录和病毒粒子包装相关的调控序列,将其反向克隆入转录载体TVT7R(0.0)中,构建了该毒株的微型基因组。当转染用辅助病毒ZJ1株感染的Hep_2细胞时报告基因得到表达,表明此微型 基因组RNA可被辅助病毒提供的NP、P和L蛋白翻译。同时将该病毒NP、P和L蛋白基因分别克隆入真核表达载体pCI_neo中,构建了表达该病毒NP、P与L蛋白的辅助质粒,用此微型基因组对辅助质粒的表达产物进行了功能鉴定并对该病毒拯救过程中痘苗病毒的最适感染剂量进行了摸索。以上研究为该病毒的成功拯救及开展其它相关研究奠定了基础。