内切葡聚糖酶高产菌株的诱变选育

【目的】建立里氏木霉(Trichoderma reesei)高产突变菌株的快速筛选方法,选育出高产内切葡聚糖酶的突变株。【方法】对里氏木霉T306菌株的初筛培养基进行优化,建立快速筛选方法;通过紫外诱变手段选育内切葡聚糖酶高产突变菌株,并对突变菌株的产酶培养基进行优化。【结果】在初筛培养基中添加浓度为0.1%(W/V)的乳糖、蛋白胨及脱氧胆酸钠有利于菌株的筛选。诱变后筛选出菌落形态发生明显变化的内切葡聚糖酶高产突变株0516,其羧甲基纤维素酶活力(CMC酶)较出发菌株提高了38.9%。其产酶培养基经优化后,得到最适碳、氮源分别为:乳糖1.50%、硫酸铵0.14%、尿素0.05%、蛋白胨0.10%,优化后CMC酶活力达64.2 U/mL,较优化前提高了2.3倍。【结论】建立了里氏木霉高产突变菌株的快速筛选方法,通过紫外诱变育种获得了产内切葡聚糖酶能力高且遗传稳定的突变株0516。     

重组青霉素G酰化酶在枯草芽孢杆菌中的表达条件优化

 为获得巨大芽孢杆菌青霉素 G酰化酶 (PGA)的高产菌株和条件 ,构建了分泌表达 PGA的基因工程枯草杆菌菌株 ,对表达条件进行了优化 .以 LB作为初始培养基 ,考察了温度、苯乙酸、装液量、碳源对于工程菌 PGA产量的影响 .实验发现重组细胞产酶不再需要变温和苯乙酸诱导 .充足的通气量和适当浓度的淀粉可使细胞密度及 PGA表达量大为提高 .表达条件优化后 ,菌体 A60 0由 3提高到 2 0 ,PGA的表达量由 3～ 6U/ml提高到 35～ 40 U/ml,为目前生产用巨大芽孢杆菌表达量的 6倍 .     

产胶原酶的蜡样芽胞杆菌发酵条件优化及酶的分离纯化

【目的】优化蜡样芽胞杆菌R75E菌株产胶原酶的条件,并通过蛋白分离纯化技术获得高纯度胶原酶。【方法】利用单因素及正交试验优化蜡样芽胞杆菌R75E产胶原酶的发酵条件及发酵培养基,将发酵液离心除菌后得到粗酶液,对其依次通过硫酸铵分级沉淀、Butyl FF疏水层析及SuperdexTM 200凝胶过滤层析等方法对目标胶原酶进行分离纯化,利用SDS-PAGE电泳检测其纯度。【结果】优化后发酵条件为培养温度41°C、接种量6%、培养时间36 h,优化后发酵培养基为葡萄糖10 g/L、蛋白胨5 g/L、起始p H 7.0,粗酶液酶活力较优化前提高了2.9倍;将该粗酶液经过一系列纯化后得到纯度超过90%的胶原酶产物,其纯化倍数和回收率分别为18.4和1.1%。【结论】获得蜡样芽胞杆菌R75E的最佳产酶条件,并对胶原酶分离纯化的方法进行了探索,为微生物胶原酶的开发应用奠定基础。     

破坏细胞壁蛋白CWP2基因提高重组酿酒酵母β-葡萄糖苷酶胞外酶活

【背景】重组酿酒酵母广泛应用于生产工业酶和药用蛋白,但是目前仍旧存在异源蛋白产量低、分泌效率差的问题,限制了生产应用。【目的】提高重组酿酒酵母异源分泌蛋白的能力,构建高效的异源蛋白生产细胞工厂。【方法】采用基于CRISPR/Cas9的基因组编辑技术,以生产β-葡萄糖苷酶的重组酿酒酵母Y294-BGL为出发菌株,构建细胞壁蛋白基因CWP2破坏菌株。【结果】与出发菌株相比,破坏CWP2的破坏菌株在发酵96 h时胞外β-葡萄糖苷酶酶活可提高53%,胞内酶活提高了208%。此外,破坏菌生长未受到影响,对弱酸等环境胁迫的耐性没有下降,未造成过多内质网胁迫。进一步检测发现,破坏菌株胞内活性氧水平下降,同时蛋白胞内运输和分泌途径相关的关键基因表达转录及多个细胞壁生物合成相关基因表达下降。【结论】破坏细胞壁蛋白基因CWP2能够提高异源蛋白β-葡萄糖苷酶的胞外酶活,可作为促进酿酒酵母生产异源蛋白的靶点基因。     

地衣芽孢杆菌TG116胞外蛋白酶产酶条件与酶学性质

【背景】从独角莲中分离得到的地衣芽孢杆菌TG116是一株对植物病原菌具有广谱抗性作用的生防菌株。【目的】优化TG116的产酶条件并探索其酶学性质,进一步了解其抗菌机制。【方法】采用Folin-Phenol显色法与响应曲面法,优化菌株TG116的产酶条件并研究其蛋白酶的酶学性质。【结果】菌株TG116产酶最适条件为:温度40.83°C,p H 8.01,发酵时间53.74 h,增加通气量可以显著提高酶活力。按照优化后的条件培养48 h后,上清液蛋白酶活力从57.46 U/mL达到了254.07 U/mL。酶学性质研究表明:该酶为碱性蛋白酶,最适反应pH为8.5,最适反应温度为50°C,具有良好的温度和pH稳定性,EDTA对酶活具有强烈的抑制作用,金属离子Mg~(2+)、Ca~(2+)、Na~+、Co~(2+)、K~+等对酶活也具有一定的抑制作用。【结论】菌株TG116具有良好的p H与温度稳定性,在实际应用中蛋白酶不易失活,可以分解真菌的细胞壁蛋白成分,破坏细胞壁结构,从而抑制甚至杀死病原菌,达到抗菌作用。     

假坚强芽胞杆菌中乙醇降解相关酶的克隆、表达及酶学特性

【目的】研究假坚强芽胞杆菌OF4中乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的酶学特性。【方法】通过引物设计,采用PCR技术从嗜碱芽胞杆菌OF4的基因组DNA中扩增获得乙醇脱氢酶(adh)基因和乙醛脱氢酶(aldh)基因,构建表达载体,通过异源原核表达,Ni-NTA柱层析纯化酶蛋白,分析其酶学特性。【结果】乙醛脱氢酶的最适反应温度为35℃,最适反应pH值为8.0,酶蛋白的活力为979.6 U/mg,其稳定性在25℃和35℃下比45℃稍好;尽管由于乙醇脱氢酶的表达量低而未能纯化获得酶蛋白,但通过双基因共表达及乙醇耐受性实验发现乙醇脱氢酶也具备较高的催化活性。【结论】成功地从假坚强芽胞杆菌OF4中克隆获得了乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶基因,二者共同作用能够较大提高宿主对乙醇的耐受性。     

一株产生淀粉酶杆菌Bacillus sp. GEL-09的筛选、鉴定及发酵条件优化

【背景】生淀粉酶可以水解生淀粉颗粒,在酒精发酵、白酒、黄酒和食醋的生料酿造工业中具有广阔的应用前景。【目的】从自然环境中筛选产生淀粉酶的菌,对其发酵条件及酶性能进行考察,为淀粉生料发酵过程提供优良菌种和酶资源。【方法】取木薯田土壤,经过稀释、热处理、富集培养以及木薯淀粉平板筛选培养基初筛,摇瓶复筛得到产高效降解生淀粉酶的菌株;经过菌落形态、细胞染色观察以及16S rRNA基因序列比对进行鉴定;对筛选菌株的发酵培养基和发酵条件进行优化,并对酶蛋白进行分离纯化和酶学性质分析。【结果】分离到一株具有较高生淀粉酶水解活力的菌株GEL-09,经鉴定为芽胞杆菌Bacillus sp.GEL-09;该菌在最优发酵条件下培养96 h,胞外酶活力达到430.6 U/m L,是优化前的2.8倍;酶学性质分析发现该酶为中温、中性酶,最适温度和p H为50°C和7.0;生淀粉降解能力对比发现,该酶的生淀粉降解能力值为62.3%,显著高于细菌α-淀粉酶、生麦芽糖淀粉酶和甘薯β-淀粉酶对生淀粉的降解能力。【结论】Bacillus sp.GEL-09在生淀粉酶生产方面具有良好的开发应用前景。     

复合诱变黑曲霉选育β—葡萄糖苷酶高产菌株

对黑曲霉原生质体进行紫外、ＬｉＣｌ复合诱变,观察诱变后原生质体再生菌落,发现了孢子色变异较大的菌株,且其变化与酶产量相关。经发酵筛选,获得β－葡萄糖苷酶活较高菌株,其酶活由出发菌株的１０ｕ／ｍｌ提高到１４．７ｕ／ｍｌ。再对高产突变株进行氮离子注入,酶活又提高２０％（达１７ｕ／ｍｌ）。     

褐藻胶降解菌的筛选、鉴定及产酶条件优化

【目的】筛选一株能降解褐藻胶的菌株,并优化产酶条件以提高褐藻胶裂解酶活力。【方法】从漳州海域采集到海水和海泥,以海藻酸钠为唯一碳源,通过富集培养、初筛、复筛筛选到一株能够降解褐藻胶的菌株。依据16S rRNA序列分析、生理生化特征、菌体形态及菌落特征对该菌进行鉴定。通过单因素和正交试验对该菌的产酶条件进行优化。【结果】该菌属于海科贝特氏菌,命名为Cobetiamarina HQZ08。该菌株最佳的产酶培养基组成为:海藻酸钠7.00g/L、蛋白胨3.00g/L、NaCl30.00g/L,K2HPO4·3H2O 1.25 g/L。最佳发酵条件为:接种量2%,接种龄12 h,培养基起始pH为7.0,培养温度25°C,培养时间24 h。优化后褐藻胶裂解酶活力达到68.5 U/mL,TLC法分析酶解产物为褐藻胶寡糖。【结论】HQZ08菌株可以用于降解褐藻胶,产生聚合度为2–6的褐藻胶寡糖。     

黑曲霉原生质体诱变选育β-葡萄糖苷酶高产菌株

本研究报道了以原生质体诱变技术选育高产β-葡萄糖苷酶的黑曲霉菌株,并研究了其发酵特性。以黑曲霉CGMCC3.316为出发菌株,通过紫外诱变得到突变株3-3M。然后以3-3M为供试菌株,研究了其原生质体制备与再生的条件。最后通过原生质体诱变,选育得到一株β-葡萄糖苷酶活力较高的突变株60B-3D。该菌株具有良好的遗传稳定性,酶活力平均达到23IU/mL,与出发菌株CGMCC3.316相比提高39%。此外,该菌株的木聚糖酶活力也有所增加。同时考察了黑曲霉60B-3D的发酵特性,并与3-3M和出发菌株进行比较,结果表明该菌株有较高的蛋白分泌能力。本研究为发酵生产β-葡萄糖苷酶提供了一株良好的供试菌株。     

用DREAM技术纠正人工合成基因中的突变

目的：介绍一种简便、有效的定点突变技术。方法：根据突变位点附近的DNA序列推导出氨基酸序列,再以此氨基酸序列进行逆翻译,这样在不改变氨基酸序列的前提下可以得到数目巨大的隐性突变体（silent mutants）,这些突变体中包含大量的限制性内切酶位点,选择合适的酶切位点设计引物用PCR技术扩增两侧DNA片段,然后以相应酶切融合这两个片段即可完成定点突变。结果：用该方法成功地在人工合成的含有缺失的可溶性组织因子基因的472位插入C,T两个碱基,校正了阅读框架,获得了预期的目的基因。结论：该方法简便、有效, 避免了多轮PCR和合成长引物导致突变的可能性,这种改进的PCR 定点诱变技术我们称之为“设计限制酶辅助突变”（Designed Restriction Enzyme Assisted Mutagenesis, DREAM）。此技术简单方便, 诱变的成功率高, 适于实验室常规应用。     

植物诱变技术的研究进展

植物诱变技术是指利用外界因素加快物种遗传变异,在短期内获得有利用价值的突变体,为培育新种质、新品种及基因功能的研究等创造条件。相对于自然的选择,诱变技术具有高频率、广突变、周期短等特性。主要论述了常用的化学诱变、物理诱变、空间诱变和生物诱变等诱变手段,并详细介绍了上述诱变技术的诱变机理、生物学效应、常用的诱变方式及其在植物应用中的研究现状。针对现行各种诱变技术的不足提出了今后努力的方向。     

苏云金芽胞杆菌还原Cr(Ⅵ)的转座子突变体库构建和分析

将高毒性的Cr(Ⅵ)还原成低毒的Cr (Ⅲ),是处理含Cr(Ⅵ)废水常用的方法之一.以高效还原Cr(Ⅵ)的苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)407为研究对象,将转座子随机突变载体pIC333转化Bt407,构建容量为1 500株的随机突变体库,从中筛选出Cr(Ⅵ)还原能力极显著差异(P＜0.01)的突变株14株.通过扩增并测定转座子插入位点的侧翼序列,确定Bt407-Cr244突变株的转座子插入位点为细胞色素氧化酶亚单位Ⅰ.Bt 407及其14株突变株的生长曲线十分相近,表明突变株Cr(Ⅵ)还原能力发生改变不是由菌株繁殖能力提高引起的.在培养24 h后,Bt 407-Cr1 49和Bt 407-Cr285培养液中的总络浓度比Bt 407极显著降低(P＜0.01),说明这2株突变株在解毒Cr(Ⅵ)过程中除了还原作用,可能还具有生物吸附,而其余12株突变子主要通过还原Cr(Ⅵ)起作用.     

家蚕核型多角体病毒基因polh的诱变分析

曾报道经化学诱变剂ＭＭＣ、９－ＡＡ和ＥＭＳ诱变的家蚕核型多角体病毒（ＢｍＮＰＶ）多角体形态出现异常,继代分离的诱变ＢｍＮＰＶ基因组对ＥｃｏＲＩ、ＢｇｌＩＩ和ＢａｍＨＩ的酶切谱发生变化。研究进一步揭示,诱变ＢｍＮＰＶ的多角体外层蛋白晶格排列呈现紊乱;多角体蛋白的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳谱与对照组比较有显著差异;对多角体蛋白基因ｐｏｌｈ的测序结果显示,３组诱变ＢｍＮＰＶ的ｐｏｌｈ基因发生了多处碱基（氨基酸     

黄霉素高产菌株的选育

目的:为了获得黄霉素高产菌株。方法:进行了一系列的诱变筛选。以加纳链霉菌(Streptomyces ghanaesis)SgWE-11为出发菌株,采用紫外线诱变,以其自身代谢物黄霉素作为筛选因子。结果:获得一株遗传稳定且黄霉素发酵效价比出发菌株高出170.25%的菌株。对该菌株采用亚硝酸诱变,并以链霉素作为筛选因子时得到一株效价值为875u/mL的高产菌株SgWE-25,比出发菌株SgWE-11提高了4.4倍。传代结果表明,在传代的同时结合自然分离,可以保持稳定的产抗特性。     

Microtiter plate quantification of mutant and wild-type huntingtin normalized to cell count

QuikChange is a popular method for site-directed mutagenesis in structural and functional studies of proteins and nucleic acids. However, the standard protocol is often inefficient in producing the desired mutations. Here we present a novel strategy for primer design, central overlapping primers (COP), which employs a pair of bipartite primers of different lengths, with the short primer complementary to the middle region of the long primer. The COP method is efficient and robust in generating approximately 90% mutation rate without supercompetent Escherichia coli cells or laborious screening for positive clones.     

原生质体紫外诱变选育姬松茸新菌株

对姬松茸原生质体进行紫外诱变处理,选育出在液体培养条件下生物量明显高于原始菌株的诱变株。经10代传代培养及摇瓶培养,表明该菌株稳定性良好,与出发菌株相比生物量提高5.5%,胞外多糖产量提高6.1%。     

Site-directed mutagenesis of UbiA to promote menaquinone biosynthesis in Elizabethkingia meningoseptica

To increase the menaquinone (MK) content of an Elizabethkingia meningoseptica, site-directed mutagenesis was generated to suppress 4-hydroxybenzoate octaprenyl transferase (UbiA) activity and subsequently blocked the ubiquinone (UQ) biosynthesis pathway. Fourteen conserved residues except L174 and G211 were mutated to analyze the effect of site-directed mutagenesis. The expression of UbiA in twelve mutants was decreased in both mRNA and protein levels, which resulted in the decrease of UQ concentration. Based on MenA expression level, 12 mutants were divided into two groups. Second group such as N72A, D76A, K81A, L139A, and D198A enhanced the expression of MenA, which increased MK production by 127.1%, 87.9%, 96.2%, 109.7% and 130.0% in wt-EmUbiA, respectively. In general, blocking UQ synthesis pathway for by site-directed mutagenesis of the active site of UbiA in E. meningoseptica was a promising strategy to increase MK production in E. meningoseptica.     

重组人睫状神经营养因子衍生物的构建、表达和活性分析

采用PCR定点突变技术对睫状神经营养因子(CNTF)基因进行改造,获得了CNTF衍生物(CNTF-D)基因序列分析证明其核苷酸序列符合设计要求,并在大肠杆菌中获得高效表达,CNTF-D表达量超过40%,复性后,经Q-Sepharose HP纯化,其纯度超过95%,体内法测定发现能明显降低实验小鼠的体重。表明CNTF-D在体内具有良好的生物学活性,为下游开发奠定了基础。