破坏细胞壁蛋白CWP2基因提高重组酿酒酵母β-葡萄糖苷酶胞外酶活

【背景】重组酿酒酵母广泛应用于生产工业酶和药用蛋白,但是目前仍旧存在异源蛋白产量低、分泌效率差的问题,限制了生产应用。【目的】提高重组酿酒酵母异源分泌蛋白的能力,构建高效的异源蛋白生产细胞工厂。【方法】采用基于CRISPR/Cas9的基因组编辑技术,以生产β-葡萄糖苷酶的重组酿酒酵母Y294-BGL为出发菌株,构建细胞壁蛋白基因CWP2破坏菌株。【结果】与出发菌株相比,破坏CWP2的破坏菌株在发酵96 h时胞外β-葡萄糖苷酶酶活可提高53%,胞内酶活提高了208%。此外,破坏菌生长未受到影响,对弱酸等环境胁迫的耐性没有下降,未造成过多内质网胁迫。进一步检测发现,破坏菌株胞内活性氧水平下降,同时蛋白胞内运输和分泌途径相关的关键基因表达转录及多个细胞壁生物合成相关基因表达下降。【结论】破坏细胞壁蛋白基因CWP2能够提高异源蛋白β-葡萄糖苷酶的胞外酶活,可作为促进酿酒酵母生产异源蛋白的靶点基因。     

MHF组蛋白折叠复合体组分编码基因MHF1过表达对重组酿酒酵母纤维素酶生产的影响

【背景】重组酿酒酵母可用于生产多种药用蛋白和工业酶等外源蛋白,但蛋白分泌水平低是限制其异源蛋白高效生产的重要因素。异源蛋白表达和分泌过程可能会对宿主细胞产生多种胁迫,因此,研究胁迫响应相关基因对重组酵母异源蛋白生产的影响具有重要意义。Mhf1p是MHF组蛋白折叠复合体的组分之一,与DNA损伤修复及维持基因组稳定性有关,但其对异源蛋白生产的作用尚不清楚。【目的】研究MHF1过表达对重组酿酒酵母蛋白生产的影响。【方法】在分泌表达纤维素酶的重组酿酒酵母菌株中利用基于CRISPR-Cas9的基因组编辑技术整合过表达MHF1,分析其对产酶的影响,并探讨影响产酶的分子机理。【结果】与出发菌株相比,过表达MHF1菌株的外切纤维素酶CBH酶活性提高了38%。对过表达MHF1的CBH生产菌株中蛋白合成和分泌途径相关基因转录水平进行检测,发现与对照菌株相比,CBH1基因和与分泌相关的SEC22、ERV29等基因在不同时间点呈现不同程度显著上调。【结论】MHF1过表达可促进酿酒酵母异源外切纤维素酶的生产,并影响外源酶基因和分泌途径基因的表达,可能通过对多基因的协同表达影响促进产酶。     

复方脑肽节苷脂注射液用于4239例出血性脑卒中患者的临床安全性再评价

摘要 目的：评价复方脑肽节苷脂注射液上市后用于4239例出血性脑卒中患者的临床安全性,从而为临床合理用药提供参考。方法：采用多中心、前瞻性、非对照的临床研究设计方法,对2020年3月至2021年3月全国46家医疗机构中使用复方脑肽节苷脂注射液的4239例出血性脑卒中患者的基本情况、用药信息、药物不良反应及疾病转归情况进行统计分析。结果：4239例出血性脑卒中患者平均用药时间（13.62±2.22）d。用药期间仅13例经研究判断为药物不良反应,不良反应发生率为0.307%,药物不良反应主要是集中在胃肠系统疾病、全身性疾病。4239例出血性脑卒中患者应用复方脑肽节苷脂注射液后有190例痊愈,3109例好转,912例无明显变化,27例病情加重,1例死亡。13例药物不良反应患者中10例患者治疗后出现好转,3例患者治疗后无明显变化。4239例出血性脑卒中患者不同用药情况中,49.99%患者药物使用剂量≤6 mL,50.0%患者药物使用剂量≧8 mL,不同药物使用剂量患者药物不良反应发生率比较无统计学差异（P>0.05）;溶媒种类以0.9%生理盐水为主,其次为5%葡萄糖,不同溶媒种类药物不良反应发生率比较无统计学差异（P>0.05）;药物注射后81.17%患者未冲管,17.65%患者冲管,1.18%患者更换输液器,不同措施药物药物不良反应发生率比较无统计学差异（P>0.05）;92.19%患者未出现不合理用药,7.81%患者存在不合理用药,二者之间药物不良反应发生率比较有统计学差异（P<0.05）。结论：复方脑肽节苷脂注射液上市后在4239例出血性脑卒中患者的治疗中不良反应发生率较低且风险可控,同时其不良反应症状均为前期已知或注射剂常见的不良反应。     

MRP8过表达促进重组酿酒酵母外切纤维素酶生产

增强酿酒酵母纤维素酶分泌能力,为提高利用联合生物加工生产纤维素乙醇的效率提供基础。采用CRISPR/Cas9基因组编辑技术,在分泌表达外切纤维素酶CBH1的酿酒酵母Y294中过表达线粒体核糖体蛋白基因MRP8。与对照菌株相比,过表达MRP8重组酵母的胞外CBH1酶活提高了约80%。实时定量PCR结果分析表明,在MRP8过表达突变体中,CBH1转录水平高于对照菌株,但是与蛋白折叠和分泌相关的关键基因转录水平没有明显变化。在刚果红平板和含有衣霉素或二硫苏糖醇的平板上生长没有受到影响。胞内ATP含量和活性氧积累未发现显著差别。本研究表明MRP8过表达促进外切纤维素酶的生产。     

UTH1基因破坏提高重组酿酒酵母分泌β-葡萄糖苷酶

异源蛋白质分泌效率低限制了重组酿酒酵母的多种药用蛋白和工业酶生产。挖掘促进蛋白质生物合成和分泌的关键基因,是提高异源蛋白质生产效率的重要手段。酿酒酵母细胞壁完整性影响异源蛋白质分泌,本研究利用基于CRISPR/Cas9的基因组编辑技术,破坏了重组酿酒酵母Y294-BGL1中参与细胞壁合成的未知功能基因UTH1,发现所获得的突变体胞外β-葡萄糖苷酶酶活比出发菌株提高112.9%,而细胞壁完整性下降。对促进产酶的分子机理进行探索,发现突变体产酶条件下与细胞壁完整性相关的关键基因和与蛋白质分泌途径相关的基因转录出现明显差异,提示UTH1基因破坏不仅影响细胞壁完整性关键基因的表达,也影响蛋白质分泌途径。本文的研究结果有助于深入理解UTH1的基因功能,并为构建异源蛋白质高分泌酵母菌株提供了借鉴。