内切葡聚糖酶高产菌株的诱变选育

【目的】建立里氏木霉(Trichoderma reesei)高产突变菌株的快速筛选方法,选育出高产内切葡聚糖酶的突变株。【方法】对里氏木霉T306菌株的初筛培养基进行优化,建立快速筛选方法;通过紫外诱变手段选育内切葡聚糖酶高产突变菌株,并对突变菌株的产酶培养基进行优化。【结果】在初筛培养基中添加浓度为0.1%(W/V)的乳糖、蛋白胨及脱氧胆酸钠有利于菌株的筛选。诱变后筛选出菌落形态发生明显变化的内切葡聚糖酶高产突变株0516,其羧甲基纤维素酶活力(CMC酶)较出发菌株提高了38.9%。其产酶培养基经优化后,得到最适碳、氮源分别为:乳糖1.50%、硫酸铵0.14%、尿素0.05%、蛋白胨0.10%,优化后CMC酶活力达64.2 U/mL,较优化前提高了2.3倍。【结论】建立了里氏木霉高产突变菌株的快速筛选方法,通过紫外诱变育种获得了产内切葡聚糖酶能力高且遗传稳定的突变株0516。     

植物非特异脂转移蛋白的研究

综述了植物抗菌蛋白nsL TPs的研究进展：植物抗菌蛋白nsL TPs是一类对细菌、真菌等微生物有抑制或杀灭作用的蛋白质：它们的抗菌能力强,有较好的耐热性,抗菌机理独特,在农业生产上有着广泛的应用前景。     

褐藻胶裂解酶基因的克隆表达及重组酶酶学性质

【目的】克隆交替假单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)BYS-2的褐藻胶裂解酶基因,实现其在大肠杆菌细胞中异源表达,对分离纯化的重组酶进行酶学性质研究。【方法】以交替假单胞菌BYS-2菌株基因组DNA为模板,克隆得到褐藻胶裂解酶基因alg738,构建重组基因工程菌BL21(DE3)/p ET22b-alg738,诱导表达,表达产物通过Ni-NTA树脂纯化后进行酶学性质研究。【结果】重组酶的最适反应p H为8.0,在p H 6.0-9.0范围内37°C保温1 h仍能保持84%以上的相对酶活力,具有较好的p H稳定性;最适反应温度为45°C,热稳定性实验显示在37°C下保温60 min其残余酶活力仍达66.6%;在5 mmol/L浓度下,Na~+、Mg~(2+)、Mn~(2+)对该酶具有明显的促进作用,Ni~(2+)、Co~(2+)、Cu~(2+)、Hg~(2+)、Zn~(2+)、EDTA、β-巯基乙醇、SDS具有明显的抑制作用。动力学参数Km、Vmax分别为1.11 g/L和0.011 g/(L·min),底物特异性分析表明该重组酶为偏好聚甘露糖醛酸钠(Poly M)裂解作用的双功能酶。【结论】重组褐藻胶裂解酶具有良好的酶学特性,为褐藻胶裂解酶的开发应用打下基础。     

海鲍分离微生物Acinetobacter sp.酯酶基因的表达和酶学性质

【目的】克隆源于海鲍内脏中一株不动杆菌Acinetobacter sp.的酯酶基因estA,并对其进行重组表达和性质研究。【方法】利用分子生物学技术克隆出酯酶基因estA并构建pPICZα-C-estA重组表达载体,并通过电转化方法将重组质粒转入毕赤酵母X33中;通过甲醇诱导培养重组菌获得重组酯酶,并对重组酯酶进行生化表征。【结果】克隆得到的estA基因序列全长912 bp,编码304个氨基酸;重组X33发酵上清液中酯酶酶活力达到1 200 U/L,重组酯酶的分子量约为33.7 kD;酶学性质研究表明重组酯酶催化底物对硝基苯乙酸乙酯水解反应的最适pH和温度为8.0和40?C,在pH 8.0-10.0温度及小于60?C时具有较好的稳定性。【结论】成功克隆了海洋来源的不动杆菌酯酶基因并在Pichia pastoris中实现了高效表达。     

蛋白质酶功能分析和预测方法的进展和前瞻

蛋白质酶是生物体内最重要的生物分子之一。对酶的功能进行系统研究具有重要的科学研究价值和工业应用意义,近年来,以计算机技术为基础的酶功能预测的方法不断发展与完善。基于此背景,本文总结了基于计算方法的酶功能分析与预测的主要方法,包括酶结合位点、分子对接、动力学模拟以及分子设计等内容。同时,本文也对相应的发展趋势进行讨论和展望。     

BbRho5对球孢白僵菌生长速率的作用研究

为阐明BbRho5对球孢白僵菌生防潜能的作用,构建了Bbrho5单基因敲除菌株ΔBbrho5,以野生型菌株WT作为对照,在不同培养基上测定菌落生长速率,并测定了菌株对多菌灵胁迫耐受性及对大蜡螟幼虫体壁侵染能力。进一步获取和分析了ΔBbrho5和WT细胞内基因转录组数据。结果表明,BbRho5蛋白功能缺陷显著抑制球孢白僵菌菌丝生长速率,同时微弱影响其多菌灵胁迫抗逆性及生防能力。相较于WT,ΔBbrho5中具有770个差异表达基因(DEGs),其中上调基因395个,下调基因375个。GO分析显示,ΔBbrho5 VS WT中DEGs主要富集于氧化还原酶活力(oxidoreductase activity)和单加氧酶活力(monooxygenase activity)功能。KEGG通路富集结果显示,DEGs主要富集于氮代谢及多种氨基酸代谢通路。在氮代谢通路中富集到7个功能基因,其中有5个上调,2个下调,说明敲除菌株可能采用增强氮源利用及谷氨酸合成以应对Bbrho5缺陷引起的生长迟缓。以上研究结果揭示了球孢白僵菌中小GTP酶BbRho5对球孢白僵菌生长速率具有重要影响,且氮代谢和氨基酸代谢可能为其重要的响应代谢通路。     

海洋来源琼胶酶的分离纯化及酶学性质研究

采用Vibiro sp.ZC-1发酵制备琼胶酶,粗酶液经过中空纤维柱浓缩、硫酸铵沉淀、DEAE-阴离子交换层析,得到一个电泳纯的琼胶酶组分Aga ZC-1,其分子质量约为45k Da,比活力为114.613U/mg。对Aga ZC-1进行酶学性质分析,结果表明,其最适反应p H为7.0,在p H为5.0~9.0时保温1h仍能保持80%以上的酶活力;最适反应温度为50℃,在45℃条件下保温1h酶活力保持在60%以上。在高浓度(5mmol/L)下,Fe~(3+)、Cu~(2+)、Sn~(2+)和Zn~(2+)能完全抑制琼胶酶的活性,在低浓度(1mmol/L)下,Cu~(2+)、Ba~(2+)、Na~+、Zn~(2+)、Ag~+、Sr~(3+)、K+对琼胶酶活性具有明显抑制作用。琼胶酶的动力学参数K_m和V_(max)分别为0.538mg/ml和6.33μmol/(L·min),对琼胶底物具有高度专一性,降解产物主要为新琼四糖和新琼六糖。     

不同搅拌器类型对齿毛菌发酵产漆酶的影响

【目的】白腐菌Cerrena unicolor Y-G07是一种不产孢子的丝状真菌,其漆酶合成与生长相偶联。应用于单细胞微生物发酵的搅拌器并不适用于白腐真菌。在此,综合考虑溶氧效果和剪切力作用,研究不同搅拌器类型对白腐菌Cerrena unicolor Y-G07发酵生产漆酶产量的影响。【方法】针对Y-G07菌株生长过程需氧量大,且对剪切力敏感的特性,订制5种不同类型的搅拌器(径向流、轴向流等),在通气已控制在设备最大量程及转速优化的前提下,研究Y-G07在发酵生产过程中使用不同类型搅拌器对菌丝生长形态、生长速度、溶氧情况、糖代谢和漆酶合成的影响。【结果】Cerrena unicolor Y-G07菌株对不同类型搅拌器产生的发酵液流态性质和剪切力敏感,表现在菌丝体的生长形态、细胞浓度差异较大,且生长周期改变,从而影响漆酶的合成。采用六折叶DT602搅拌器最有利于该菌株形成致密度合适的网状菌丝体,菌丝体细胞浓度高,断裂少、生长状况好,漆酶的单位产量可达690 U/m L,相对于普通使用的六叶平直叶搅拌器(448 U/m L)提高了54%。【结论】选择合适的搅拌器类型有利于好氧但对剪切力敏感的微生物发酵。     

产高温纤维素酶木霉菌株的筛选、鉴定及酶学性质研究

从稻草堆肥中筛选得到一株产高温纤维素酶的霉菌M1,通过形态学观察和分子生物学鉴定,确定其为木霉属(Trichoderma)。在稻草液体发酵培养基中,木霉M1的CMC酶(carboxymethyl cellulase,CMCase)合成模式为同步合成型。酶学性质研究表明,此CMC酶的最适反应pH为4.4,在pH 4.0～6.0保温4h仍可保持95%以上的酶活力;其最适反应温度为75℃,在50℃下保温4h,可保持87%的酶活力;60℃下保温4h,可保持65%的酶活力,具有较好的热稳定性。     

罗尼氏弧菌Vibrio shilonii BY新琼胶酶基因的克隆、序列分析及表达

【目的】从海洋来源的罗尼氏弧菌菌株BY中克隆得到一个具有琼胶酶活性的新基因,并对其进行重组表达。【方法】对实验室保藏的产琼胶酶菌株BY进行16S rRNA基因序列分析,并构建系统发育树。根据已报道的琼胶酶基因序列的同源性,设计简并引物,利用降落PCR (Touch-down PCR)及染色体步移技术扩增琼胶酶基因序列全长,对基因序列进行生物信息学分析。将目的基因插入pET22a(+)载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),对重组酶进行表达,利用DNS法测定了重组酶的酶活,对该重组琼胶酶酶学性质进行研究。【结果】克隆得到一条新的琼胶酶基因,命名为Vibrio sp. BY (GenBank登录号：AIW39921.1),Vibrio sp. BY基因序列全长2 232 bp,编码744个氨基酸,理论分子量为85 kD,Vibrio sp. BY的氨基酸序列基因库中与已知的琼胶酶氨基酸序列Vibrio sp. EJY3的相似度为86%。发酵液琼胶酶酶活力为71.73 U/mL,证明表达的蛋白为琼胶酶。酶学性质研究表明重组琼胶酶的最适温度及pH分别为50 °C和7.0,并且具有较好的稳定性。【结论】利用染色体步移技术克隆得到一条新的琼胶酶基因,并在大肠杆菌BL21(DE3)中实现了重组表达,为琼胶酶的应用奠定了基础。