小鼠Daintain/AIF-1基因启动子的克隆及其荧光素酶报告基因载体的构建

目的：对Daintain/AIF-1（大炎肽/同种异体移植炎症因子-1）基因启动子进行克隆并构建荧光素酶报告基因载体,为进一步研究Daintain/AIF-1的转录调控作用提供了质粒资源。方法：提取单核巨噬细胞系RAW264.7基因组DNA,以其为模板采用PCR方法克隆出Daintain/AIF-1基因5＇端UTR区1.6 kb DNA序列,将该序列同源重组到pGL3-Basic载体上,转化感受态DH5α并酶切鉴定和测序。结果：PCR产物片段与预期结果一致,Daintain/AIF-1基因5＇端UTR区1.6 kb DNA序列连接到pGL3-Basic载体上,构建成pGL3-Basic-Daintain/AIF-1（pGL3-Basic-DT）载体,酶切结果与理论预测值一致,经测序证实无碱基突变。结论：Daintain/AIF-1基因报告基因载体的构建为进一步研究Daintain/AIF-1转录调控作用提供了载体资源。     

bax转录调控pGL3-Basic荧光素酶报告基因载体的构建

目的:构建能用来检测bax转录调控作用的报导基因载体.方法:采用PCR方法克隆出bax 5'UTD基因,构建载体后利用酶切与测序进行鉴定.然后将该基因亚克隆至pGL3-Basic报告基因载体上.结果:克隆基因产物酶切结果与理论预测值一致,测序未出现一个碱基突变.PCR鉴定发现,bax5'UTD正确连接到了pGL3-Basic报告基因载体上,构建了pGL3-Basic-Baxregular载体.结论:bax 5'UTD报导基因载体的构建为进一步研究bax转录调控作用提供了载体资源.     

FLT-1启动子荧光素酶报告基因重组体的构建和鉴定

目的：为探索FLT-1启动子靶向调控活性分析,克隆FLT-1启动子基因序列,构建并鉴定肿-1启动子调控的荧光素酶报告基因重组体pGL3-FLT—Basic—luc。方法：应用聚合酶链式反应（PCR）技术扩增FLT-1启动子序列,定向亚克隆至荧光素酶表达载体pGL3-Basic—luc中,构建含有正确目的基因的报告基因重组体pGL3-FIT—Basic—luc,通过限性内切酶酶切、PCR及测序进行鉴定。结果：通过酶切鉴定及基因测定证明,所克隆的基因产物与预期结果-致,序列无碱基突变。结论：成功构建了含有FLT-1启动子基因序列的荧光素酶报告基因真核表达载体,为下-步分析该启动子活性及血管疾病的基因治疗奠定基础。     

小鼠组蛋白H3K4甲基化酶Smyd3启动子荧光素酶报告载体的构建与活性分析

为研究小鼠(Mus musculus)组蛋白H3 K4甲基化酶基因Smyd3转录调控的分子机制,本研究首先通过PCR的方法克隆了5条不同长度的Smyd3启动子5’端缺失片段,与pMD19-T载体连接后,双酶切克隆入pGL3-Basic荧光素酶报告基因载体,构建Smyd3启动子-pGL3-Basic报告基因重组质粒,瞬时转染HEK293细胞48 h后采用双报告基因检测试剂盒检测Smyd3启动子各缺失片段的相对荧光活性.结果表明,本研究成功构建Smyd3启动子5’端缺失片段-pGL3-Basic荧光报告基因重组质粒,所构建的启动子重组子转染组与阳性对照组相比表现出荧光活性,并且pGL3-Smyd3-4的荧光活性最强,是其他的2至4倍左右,pGL3-Smyd3-5的荧光活性最弱.本研究初步确定Smyd3基因的启动子核心区域可能位于-533～-42bp之间,在-2026～-533 bp之间可能存在启动子负调控序列.     

含G0S2基因启动子的荧光素酶报告基因载体的构建

目的:克隆人G0S2基因启动子并构建荧光素酶报告基因载体,为进一步研究G0S2基因转录调控提供质粒。方法:利用PCR技术从人胚肾293A细胞基因组DNA中克隆获得G0S2基因启动子的DNA片段,将其克隆至pGL3-basic表达载体中,并转化人大肠杆菌DH5α,经限制性内切酶酶切、PCR及测序鉴定得到确认;将重组载体质粒与半乳糖苷酶表达质粒psV-β-Galactosidase共转染至大鼠血管平滑肌细胞(VSMC),检测细胞中荧光素酶的活性。结果:pGL3-G0S2-Promoter重组质粒插入片段和相邻序列正确,克隆的G0S2基因片段有启动子活性(P0.05)。结论:成功构建了pGL3-G0S2-Promoter报告基因质粒,为进一步研究G0S2基因的表达奠定了基础。     

团头鲂促性腺激素GtH Iβ亚基基因5''端启动子区克隆及表达载体构建

本研究利用改进的锚定PCR方法克隆了团头鲂（Megalobrama amblycephala）促性腺激素IB（GtHIβ）亚基基因5＇端侧翼序列,并在生物信息学方法分析的基础上构建了荧光素酶质粒表达载体。序列分析结果显示：克隆得到的GtHIβ亚基基因5’端侧翼序列长度为479bp,其中包括TATA盒、ARE、PRE、ERE、SF-1、Ptxl等可能对GtHIp亚基基因转录调控起重要作用的功能转录因子结合位点。利用PCR方法在基因组中扩增得到了3个缺失片段,并同全长片段一起分别连接至pGL3-Basic报告基因载体,成功构建了团头鲂GtHIp亚基基因5’端侧翼序列的表达载体,为进一步研究、分析其转录调控机制提供了基础。     

PD-1核心启动子的获得及活性鉴定

目的:构建PD-1(programmed death receptor 1)全长启动子及不同截短体的报告基因,并对其转录活性进行检测。方法:通过PCR及双酶切方法,从人全血基因组DNA中获得PD-1基因编码序列,包含不同长度碱基的PD-1启动子序列,分别克隆到报告基因pGL3-Basic载体上,构建8个不同长度PD-1启动子的报告基因;用脂质体转染法将8个报告基因分别转染至Jurkat细胞系;采用双萤光素酶报告基因系统评估PD-1启动子的活性。结果:经PCR方法扩增出大小分别为1650、1450、1250、1128、874、674、474和274 bp的不同长度的PD-1启动子序列,测序正确(与GenBank报道一致),酶切鉴定正确;瞬时转染Jurkat细胞系后经报告基因检测,8个启动子均具有转录活性。结论:构建了PD-1启动子的报告基因,并证实均有转录活性,且以pGL3-1128活性最高,为PD-1的核心启动子,为进一步研究PD-1的转录调控奠定了实验基础。     

人连接蛋白43基因启动子活性区域分析

利用PCR技术从基因组DNA中获得不同长度的Cx43基因启动子片段,克隆至荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic中,瞬时转染成纤维细胞,通过荧光素酶活性检测,分析不同启动子区域的转录调控能力。结果显示Cx43基因不同长度的启动子荧光素酶报告基因载体被成功构建,它们在成纤维细胞中的活性不同:535~-1区域可能为Cx43基因启动子的核心转录调控作用区,这为进一步研究Cx43在成纤维细胞中的转录调控特点奠定了基础。     

用于鉴定microRNA靶基因的新型双萤光素酶报告基因系统的构建及应用

目的:构建用于鉴定microRNA靶基因的报告基因系统。方法:在pGL3-Basic载体的luc基因上游插入CMV启动子,下游插入用于克隆靶基因3’UTR的多克隆位点,构建报告基因载体pMIR-luciferase;将pMIR-lu-ciferase载体的luc基因替换成Rluc基因,构建内参载体pMIR-control;将补体因子H(CFH)的3’UTR插入pMIR-luciferase载体的多克隆位点处,构建含有CFH 3’UTR的报告基因载体;用pIRES2-EGFP载体构建microRNA146a真核表达载体;将含有CFH 3’UTR的报告基因载体、microRNA146a真核表达载体及内参载体共转染HepG2细胞,进行报告基因的活性检测。结果:构建了报告基因载体、内参载体和microRNA146a真核表达载体,经酶切和测序鉴定正确;microRNA146a真核表达载体转染细胞72 h后,经荧光显微镜观察确认载体转染及表达;用实时定量PCR检测,microRNA146a的表达水平显著上调(P<0.01);用构建的报告基因系统检测,结果表明microRNA146a显著地抑制了含CFH 3’UTR的报告基因的活性(P<0.05)。结论:构建了一种新型的报告基因载体系统,该系统可用于miRNA靶基因的鉴定。     

CYP7A1基因启动子克隆及萤光素酶报告基因载体构建

目的:克隆细胞色素P450 7A1(CYP7A1)基因启动子,构建以CYP7A1基因启动子为启动序列的双萤光素酶报告基因系统并分析其活性,为研究CYP7A1基因转录调控提供有效筛选工具。方法:采用PCR方法克隆CYP7A1基因启动子序列,连接到pUC57载体中,双酶切后连接至萤光素酶报告质粒pGL3-Basic上,构建重组萤光素酶报告质粒pGL3-CYP7A1-promoter-luc。结果:重组质粒经双酶切和测序,证实构建正确;pGL3-CYP7A1-promoter-luc质粒2、3转染HepG2细胞均具有显著性启动子活性,pGL3-CYP7A1-promoter-luc2转染24和48 h后经检测分别为对照组(pGL3-basic空载体)的13.1±2.8倍(P0.001)和23.3±2.9倍(P0.001);pGL3-CYP7A1-promoter-luc3转染24、48 h后,荧光响应值分别是对照组的8.4±1.6倍(P0.001)和22.1±1.9倍(P0.01),呈现强启动子活性。结论:构建了CYP7A1基因启动子萤光素酶报告基因重组质粒pGL3-CYP7A1-promoter-luc,为后续深入研究药物对其调控作用机制奠定了基础。     

类胡萝卜素合成的相关基因及其基因工程

类胡萝卜素具有多种生物功能,尤其在保护人类健康方面起着重要的作用,如它们是合成维生素A的前体,能够增强人体免疫力和具有防癌抗癌的功效。人体自身不能合成类胡萝卜素,必须通过外界摄入;但类胡萝卜素在许多植物中含量较低,并且很难用化学方法合成。随着类胡萝卜素生物合成途径的阐明及其相关基因的克隆,运用基因工程手段调控类胡萝卜素的生物合成已成为可能。本文综述了微生物和高等植物类胡萝卜素生物合成途径中相关基因的克隆,以及运用这些基因通过异源微生物生产类胡萝卜素和提高作物类胡萝卜素含量的基因工程研究进展。     

大绿蛙Sox基因和Dmrt基因的序列分析

Sox基因家族与Dmrt基因家族在胚胎发育及性别分化中起着重要作用。采用PCR方法,扩增了大绿蛙Sox基因和Dmrt基因的保守区,分别获得长约220 bp和140 bp的片段。序列分析表明,大绿蛙雌雄个体之间Sox基因、Dmrt基因序列没有差异,与人和其它动物的Sox基因、Dmrt基因有非常高的相似性,显示了Sox基因及Dmrt基因在系统进化上的高度保守性。本研究为探讨大绿蛙的性别决定机制及Sox基因与Dmrt基因的进化提供了分子资料。     

乔丹基因:在团藻中发现的跳跃基因

Ｄａｖｉｄ Ｋｉｒｋ 和 Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｍ ｉｌｌｅｒ 最近用一种特殊的转座子 乔丹基因作为标记克隆了两个控制团藻发育的重要基因：ｇｌｓ Ａ 基因和 ｒｅｇ Ａ 基因⒚他们的这一工作可能为遗传学研究开辟了一条新的道路⒚     

硫霉素环化酶基因在变铅青链霉菌TK24中的表达及基因定位

将含有硫霉素环化酶基因的重组质粒p6BCl2转化变铅青链霉菌(Streptomyceslividans)TK24,含有p6BCl2的转化子细胞抽提液分别与琉霉素生物合成阻断变株Y,发酵液以及纯化的Y。中间产物经过体外共培养可产生活性物质．化学分析表明与Y,发酵液混合后产生的是硫霉素,与纯化的Y。中间产物混合产生的是一种不稳定的活性物质。说明硫霉素环化酶基因在S.lividans TK24中得到了表达,其产物以Y。中间产物为底物并弥补了Y,中的缺陷。对p6Bcl2中4．5kb外源片段进行了限制酶酶切分析,建立了酶切图谱．利用含硫霉素环化酶基因的S．Lividans TK24转化子体外转化Y,的应用体系,将硫霉素环化酶基因定位在0．9kb Hinc I—Pst I片段上,并证明了硫霉紊环化酶的活性与IPNS同源片段无关。以上实验为进一步研究琉霉素环化酶基因的结构打下了基础。     

利用基因诱捕技术进行小鼠基因剔除的初步研究

对利用基因诱捕技术进行小鼠基因剔除做了初步的探索,为进一步应用该技术进行小鼠基因功能研究奠定了基础.利用基因诱捕载体转染小鼠ES细胞,获得了36株neo基因单拷贝整合的诱捕ES细胞,其中14株细胞表达有活性的β半乳糖苷酶.将3株诱捕ES细胞分别经显微注射引入到受体囊胚中,再植入假孕母鼠的子宫中使其发育成小鼠.两株细胞得到了程度不同的嵌合体小鼠,其中一株诱捕ES细胞整合至生殖系.利用质粒拯救实验获得了诱捕载体整合位点附近的基因组序列,通过序列比对发现被诱捕的基因可能是一个新基因.X-gal染色结果显示,该基因的表达局限于小鼠腹部及肢芽的部位.     

Adiponectin 基因剔除LacZ基因敲入小鼠模型的建立

adiponectin是脂肪细胞特异分泌的一种活性蛋白质,具有增加胰岛素敏感性、抗炎及抗动脉硬化等活性.建立adiponectin基因剔除β-半乳糖苷酶基因(LacZ)敲入小鼠模型,可为整体动物水平研究adiponectin基因功能及其表达调控机制等提供理想工具.根据生物信息学方法获得adiponectin基因组序列,设计基因剔除及敲入策略,在adiponectin基因第2和第3号外显子剔除的同时,在其ATG和信号肽序列后顺接LacZ基因完整编码序列,构建完成了Adipo-LacZ-XpPNT基因剔除质粒.通过电穿孔将打靶质粒转入ES细胞,以G418和ganciclovir进行药物筛选,获得药物抗性的ES细胞克隆,PCR和DNA印迹鉴定出正确同源重组克隆.将同源重组的ES细胞克隆注入小鼠囊胚得到嵌合体小鼠,嵌合体小鼠与C57BL/6J小鼠交配产生杂合子小鼠,杂合子间交配获得adiponectin基因剔除LacZ基因敲入纯合子小鼠.经RT-PCR、RNA印迹和ELISA检测证实纯合子小鼠脂肪和血清中adiponectin基因表达呈阴性.RT-PCR、RNA印迹及蛋白质印迹检测发现,LacZ基因在突变小鼠脂肪组织中有特异性表达,其表达谱与内源性adiponectin基因的表达谱一致.但在脂肪组织及外周血中未能检测到LacZ活性,且血清中LacZ蛋白亦呈阴性.由此成功建立了adiponectin基因完全灭活及LacZ基因以内源性adiponectin基因表达谱表达的小鼠模型,为进一步研究该基因功能及其表达调控创造了有利条件.     

Smad7基因的克隆、表达及对c-myc基因的调控

Smad7是TGr-β家族信号转导通路的抑制分子,可反馈调节TGF-β／Smads信号转导通路,从功能推测,Smad7表达紊乱,可影响细胞对TGF-β的应答,从而促进细胞的恶性化进展,为了深入探讨Smad7基因功能,通过设计引物,用Touchdown巢式．PCR法从人胎脑文库中扩增Smad7基因编码区全长,回收产物,克隆并构建真核表达载体,同融合有报告基因的c-myc顺式增强子元件共转染BEP2D细胞,结果表明：TGF—p可抑制c．myc报告基因的活性,Smad7基因可正调控c．myc报告基因的表达,并拮抗TGF．B对该基因的抑制作用．由此得出结论：Smad7基因通过桔抗TGF．B来调控c．myc基因、     

MADS-box基因家族基因重复及其功能的多样性

基因的重复(duplication)及其功能的多样性(diversification)为生物体新的形态进化提供了原材料。MADS-box基因在植物(特别是被子植物)的进化过程中发生了大规模的基因重复事件而形成一个多基因家族。MADS-box基因家族的不同成员在植物生长发育过程中起着非常重要的作用,在调控开花时间、决定花分生组织和花器官特征以及调控根、叶、胚珠及果实的发育中起着广泛的作用。探讨MADS-box基因家族的进化历史有助于深入了解基因重复及随后其功能分化的过程和机制。本文综述了MADS-box基因家族基因重复及其功能分化式样的研究进展。     

基因打靶突变小鼠与基因功能研究

ES细胞是建立基因打靶突变小鼠的必要条件 ,也可用于制备转基因动物 .基因敲除、精细突变和条件性基因打靶技术建立的基因打靶突变小鼠在人类遗传病机理研究、基因治疗和基因功能研究方面都有着重要作用 .     

应用果蝇yellow基因的分子模式分析基因转应作用(英文)

基因转应作用（ｔｒａｎｓｖｅｃｔｉｏｎ）是基因表达的一种方式,这种方式是由等位基因配对及其相互作用所介导的。基因转应作用的现象已在果蝇的多种基因中发现。这种作用可产生正负两种效应。而且,在其它物种中,也逐渐发现了类似的现象。例如,在植物中的基因沉默现象（ｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）以及在小鼠中的基因转激活作用（ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）等。因此,阐明基因转应作用的机理,将有助于了解基因表达调节及增强子调控活动的分子基础。本文应用果蝇ｙｅｌｏｗ基因为模式来探讨基因转应作用的分子机制。前期研究表明,ｙｅｌｏｗ基因转应作用发生于ｇｙｐｓｙ诱导的ｙ２突变种和ｙｅｌｏｗ亚等位基因（ｙｈ）之间。为了证实是否ｇｙｐｓｙ是基因转应作用所必需的ＤＮＡ元件,我们鉴定了一种新的ｙｅｌｏｗ突变种,称为ｙ２３７４。ｙ２３７４突变是一种基因表达的组织特异性改变,这一改变使ｙ２３７４果蝇在翅和身体部位表皮着色呈突变型。通过遗传分析表明,ｙ２３７４也可与ｙｈ（如ｙ１＃８）产生基因转应作用。ｙ１＃８是一种无效的ｙｅｌｏｗ等位基因,它包含一个启动子和部分编码区序列的缺失。然而,当ｙ２３７４与ｙ１＃８杂交后,其杂交后代的表现型可由ｙ２３７