EphA3基因启动子区域定位表达及活性分析

目的构建含有不同长度EphA3基因启动子片段的报告基因载体,研究其在293T细胞和MEF细胞中的转录活性。方法以Balb／C小鼠基因组DNA为模板,扩增不同长度的EphA3基因启动子片段,并克隆进入荧光素酶报告基因质粒pGL3-Basic真核表达载体内。酶切鉴定及基因测序无误后,将重组质粒和pRL—CMV内对照质粒共转染293T和MEF细胞,分析不同长度的OhA3基因启动子片段的转录活性。结果酶切和测序鉴定表明表达载体构建成功,EphA3基因的核心启动子区域位于-279bp～＋110bp之间,在293T细胞和MEF细胞中其转录活性相似。结论成功构建了荧光素报告基因重组质粒,并确定了BphA3基因的核心启动子区域。     

IL-37基因启动子的克隆及其荧光素酶报告基因载体的构建

[目的]克隆白介素-37(IL-37)基因启动子,构建其荧光素酶报告基因载体,并分析活性。[方法]用PCR方法扩增IL-37基因5'端上游区3个不同长度的启动子片段,分别克隆入荧光素酶报告基因载体p GL3,构建IL-37基因启动子荧光素酶报告基因质粒。将所构建的质粒转染HEK-293细胞,通过双荧光素酶报告基因系统分析启动子的转录活性。[结果]754、1 017、2 043 bp等3个IL-37启动子片段正确亚克隆入荧光素酶报告基因载体,重组质粒转染HEK-293细胞后,双荧光素酶活性分析显示1 017 bp的启动子片段具有较强转录活性,约为对照组(空载体p GL3-basic)的10.9倍。[结论]成功克隆IL-37基因启动子,构建了大小为1 017 bp的IL-37基因启动子荧光素酶报告基因载体,为IL-37表达的调控机制的研究提供有效的工具。     

棉铃虫细胞色素P450 CYP6B6基因启动子活性检测条件的优化

旨在用阳离子脂质体介导携带有pGL3-Basic报告基因的棉铃虫细胞色素P450 CYP6B6启动子pGL-CYP6B6-promoter重组质粒转染Sf9细胞,对启动子活性的检测条件进行优化。将长度为999 bp的棉铃虫CYP6B6基因启动子亚克隆至荧光素酶报告载体pGL3-Basic上,提取无细胞内毒素的质粒,转染处于对数生长期的昆虫细胞Sf9,通过检测荧光素酶的表达量验证启动子的活性。对转染后的检测时间、加入转染质粒的量,转染质粒与内对照质粒pRL-TK的比例分别进行了优化,进而确定检测的最优条件。结果表明,转染后的最适检测时间为24 h,转染质粒的最适用量为3.2μg,报告质粒与内对照质粒用量的比例为10 1时转染效率最高。     

人β1整合素启动子核心启动序列初步分析

目的:分析人β1整合素在HaCat细胞中核心启动片段.方法:以本室构建的含整合素β1全长启动子1745 bp基因序列(-1745bp～+11 bp)的重组栽体pGL3-1756为模板,用含有酶切位点的特异性引物扩增出整合素β1启动子-845 bp～304bp间基因序列,克隆至荧光素酶表达载体pGL3 basic,构建含正确目的基因重组载体pGL3-542.用pGL3-1756、和pGL3-542质粒转染人表皮细胞株HaCat进行活性分析.结果:酶切及序列测定表明,克隆后插入pGL3 basic中的启动子片段与GenBank DNA序列数据库对比分析序列一致,且插入方向正确.在人永生化表皮细胞株(HaCat细胞)中构建的pGL3-542载体具有很强的启动活性.结论:成功构建了整合素Bl远端启动子542 bp片段载体,在HaCat细胞中具有非常强的启动活性.人整合素β1整合素启动子核心启动序列可能位于-845 bp～-304 bp.     

小鼠Daintain/AIF-1 基因启动子的克隆及其荧光素酶报告基因 载体的构建

目的:对Daintain/AIF-1(大炎肽/同种异体移植炎症因子-1)基因启动子进行克隆并构建荧光素酶报告基因载体,为进一步研究Daintain/AIF-1的转录调控作用提供了质粒资源。方法:提取单核巨噬细胞系RAW264.7基因组DNA,以其为模板采用PCR方法克隆出Daintain/AIF-1基因5’端UTR区1.6 kb DNA序列,将该序列同源重组到pGL3-Basic载体上,转化感受态DH5α并酶切鉴定和测序。结果:PCR产物片段与预期结果一致,Daintain/AIF-1基因5’端UTR区1.6 kb DNA序列连接到pGL3-Basic载体上,构建成pGL3-Basic-Daintain/AIF-1(pGL3-Basic-DT)载体,酶切结果与理论预测值一致,经测序证实无碱基突变。结论:Daintain/AIF-1基因报告基因载体的构建为进一步研究Daintain/AIF-1转录调控作用提供了载体资源。     

人Tudor-SN基因启动子荧光素酶报告基因表达质粒的构建及活性检测

目的 将人类Tudor-SN基因的启动子序列片段定向连入pGL3-Basic质粒载体,并进行鉴定和启动子活性检测.方法 以HeLa细胞全基因组DNA为模板,PCR法扩增出目的基因,利用XhoⅠ和HindⅢ双酶切法将目的片段连接到pGL3-Basic载体上.再将构建成功的pGL3-Basic-Tudor-SN-promoter重组质粒和内参质粒β-gal瞬时共转染入宫颈癌HeLa细胞,培养48 h后检测萤火虫荧光素酶活性.结果 双酶切和基因测序法鉴定构建的重组质粒无误,转染重组质粒后可检测到萤火虫荧光素酶活性.结论 成功构建了人类Tudor-SN基因启动子重组质粒,为Tudor-SN蛋白基因调控机制的研究奠定基础.     

人转化生长因子-β2启动子区低氧反应元件突变体报告基因的构建

目的:构建人转化生长因子-β2(Transforming growth factor-β2,TGF-β2)启动子区低氧反应元件(hypoxia responsive element,HRE)突变体报告基因.方法:利用重叠延伸PCR技术,以人TGF-β2启动子区报告基因(TGF-β2-pGL3-Basic)为模板,对TGF-β2启动子区(-270bp～ 280bp)-114 bp、-73bp、-49bp、-4bp和-73/-49bp位点的低氧反应核心序列5'-RCGTG-3'分别进行定点突变,然后将此突变片段插入荧光素酶报告载体pGL3-Basic进行基因测序.结果:各突变载体的测序结果与预期完全一致.结论:人TGF-β2启动子区HRE突变体报告基因构建成功,为今后进一步研究TGF-β2的低氧调控奠定了基础.     

含VEGF启动子的报告基因的构建及雌激素受体对其活性的影响

目的：构建含血管内皮生长因子（VEGF）基因启动子的荧光素酶报告基因载体,并检测其在雌激素受体作用下的转录活性。方法：以乳腺癌细胞系MCF-7基因组为模板,扩增VEGF启动子片段,克隆到荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中。用脂质体介导的基因瞬时转染法,将重组正确的报告基因载体转染293T细胞,检测重组质粒中荧光素酶报告基因的表达。结果：酶切鉴定和DNA序列分析表明构建了正确的pGL3-basic—VEGF报告基因载体;转录活性实验表明构建的报告基因载体具有启动子活性,雌激素受体α（ERα）能以剂量依赖的方式升高VEGF启动子调控下的报告基因的转录。结论：克隆了VEGF启动子,为ERα共调节子的功能研究奠定了基础。     

鸡miR-17-92基因簇上游调控区功能分析

miR-17-92基因簇(miR-17-92 cluster)在细胞增殖、分化、凋亡、动物发育以及肿瘤发生等过程中发挥重要作用。目前,人和小鼠等哺乳动物miR-17-92基因簇的转录调控已有深入研究,但该基因簇在鸡等鸟类中的转录调控研究还未见报道,主要原因在于鸟类miR-17-92基因簇上游的基因组序列都存在一个gap,且该基因簇启动子的位置和序列也还不清楚。为此,本研究采用染色体步移的方法获得鸡miR-17-92基因簇上游gap区序列,并采用生物信息学分析和报告基因及截短突变技术开展该gap区的功能分析。染色体步移分析发现,鸡miR-17-92基因簇上游gap区全长1704 bp,GC含量达80.11%。生物信息学分析显示,鸡miR-17-92基因簇上游gap区内1段200 bp的序列与人、牛、小鼠等9种动物miR-17-92基因簇上游序列保守性较高,且该区域为人和小鼠等哺乳动物miR-17-92基因簇宿主基因的核心启动子区。将克隆的gap区序列插入pGL3 basic荧光素酶报告基因载体,构建成启动子荧光素酶报告基因载体pGL3-cMIR17HG(-4228/-2506)。荧光素酶报告基因活性分析表明,pGL3-cMIR17HG(-4228/-2506)报告基因的活性是pGL3 basic空载体活性的417倍,证明所克隆的gap区片段是鸡miR-17-92基因簇宿主基因的启动子。为进一步分析该启动子的结构和功能,构建gap区片段的5°端缺失突变(缺失448 bp)和3°端缺失突变(缺失894 bp)的荧光素酶报告基因载体。与pGL3-cMIR17HG(-4228/-2506)相比,5°端和3°端缺失突变分别使启动子报告基因活性降低19.82%和60.14%。这些数据提示,鸡miR-17-92基因簇宿主基因启动子的重要调控区位于-3400/-2506。本研究结果为进一步开展鸡miR-17-92基因簇的转录调控奠定了基础。     

小鼠Daintain/AIF-1基因启动子的克隆及其荧光素酶报告基因载体的构建

目的：对Daintain/AIF-1（大炎肽/同种异体移植炎症因子-1）基因启动子进行克隆并构建荧光素酶报告基因载体,为进一步研究Daintain/AIF-1的转录调控作用提供了质粒资源。方法：提取单核巨噬细胞系RAW264.7基因组DNA,以其为模板采用PCR方法克隆出Daintain/AIF-1基因5＇端UTR区1.6 kb DNA序列,将该序列同源重组到pGL3-Basic载体上,转化感受态DH5α并酶切鉴定和测序。结果：PCR产物片段与预期结果一致,Daintain/AIF-1基因5＇端UTR区1.6 kb DNA序列连接到pGL3-Basic载体上,构建成pGL3-Basic-Daintain/AIF-1（pGL3-Basic-DT）载体,酶切结果与理论预测值一致,经测序证实无碱基突变。结论：Daintain/AIF-1基因报告基因载体的构建为进一步研究Daintain/AIF-1转录调控作用提供了载体资源。     

小鼠Lrp5基因5′端调控区域的功能

为研究小鼠低密度脂蛋白(LDL)受体相关蛋白5(LRP5)基因5′端调控序列的功能,PCR扩增小鼠Lrp5基因翻译起始位点上游3041bp(-2909bp~+132bp)DNA序列.PCR产物定向克隆到pGL3-basic载体上,重组质粒命名为pGL3-2909.以pGL3-2909质粒为模板,以不同的引物扩增出不同长短的DNA片段,分别定向克隆到含小鼠Lrp5基因基本启动子并含有荧光素酶报道基因的pGL3-103载体上,构建了12种荧光素酶报告基因表达体系:pGL3-267,pGL3-513,pGL3-535,pGL3-560,pGL3-575,pGL3-623,pGL3-645,pGL3-719,pGL3-770,pGL3-1032,pGL3-1330,pGL3-1619.以pRL-TK为内参照质粒,瞬时转染COS-7细胞,48h后收集细胞测定荧光素酶相对表达活性,pGL3-575(-2909bp~-2334bp)活性是pGL3-513(-2909bp~-2396bp)的20%,pGL3-535(-2909bp~-2374bp)的活性是pGL3-513的44%,pGL3-575的活性是pGL3-560(-2909bp~-2349bp)的48%,均有显著性差异.结果表明,在-2396bp与-2374bp之间的22bp区域内以及-2349bp与-2334bp之间的15bp区域内存在负调控元件.软件分析表明,此区域含有IK2,LYF1及MZF1调控元件.     

热休克转录因子1对高迁移率族蛋白B1的转录调控作用及机制

目的：探讨烧伤血清诱导下热休克转录因子1（HSF1）对高迁移率族蛋白B1（HMGB1）的转录调控作用及其机制.方法：构建热休克转录因子1真核表达载体pcDNA3.1-HSF1,HMGB1野生型启动子荧光素酶报告基因pGL3-HMGB1-Y,HMGB1突变型启动子荧光素酶报告基因pGL3-HMGB1-T.pcDNA3.1-HSF1转染巨噬细胞RAW264.7,烧伤血清诱导后,半定量RT-PCR检测HMGB1 mRNA的表达.pcDNA3.1-HSF1,HMGB1启动子荧光素酶报告基因共转染RAW264.7,烧伤血清诱导后,检测并比较pGL3-HMGB1-Y和 pGL3-HMGB1-T的相对萤光素酶活性.结果：烧伤血清诱导下,HSF1可以下调RAW264.7 HMGB1mRNA的表达.pGL3-HMGB1-T的相对荧光素酶值较pGL3-HMGB1-Y明显下降,P＜0.01,差异有显著统计学意义.结论：烧伤血清诱导下,HSF1可能通过与HMGB1启动子区HSE的结合下调小鼠巨噬细胞RAW264.7 HMGB1mRNA的表达.     

大鼠GluR2基因启动子控制的萤火虫荧光素酶表达载体的构建

目的构建大鼠GluR2基因启动子控制的萤火虫荧光素酶表达载体,并检测其在神经元中的表达。方法采用PCR方法获得GluR2基因启动子区目的片段（-298～＋283）,双酶切后插入到pGL3-Basic载体中构成重组表达载体,使萤火虫荧光素酶报告基因的表达受GluR2启动子控制。将构建的重组表达载体或pGL3-Basic载体分别与内参质粒pRL—CMV（表达海肾荧光素酶）共转染原代培养皮质神经元,24h后用双荧光检测试剂盒测定萤火虫荧光素酶及海肾荧光素酶活性。结果重组表达载体经双酶切及测序鉴定证明构建正确,该重组表达载体在神经元中特异性高表达萤火虫荧光素酶。结论成功构建大鼠GluR2基因启动子控制的萤火虫荧光素酶表达载体,并检测到该载体在神经元中的特异性表达。     

徐州医学院病原生物学与免疫学教研室

目的:建立高活性的PSA启动子荧光素酶报告载体。方法:提取前列腺癌细胞PC-3总DNA,PCR扩增出PSA启动子片段,建立PSA启动子荧光素酶重组载体PGL3-psap,通过脂质体介导将重组载体转染到前列腺癌细胞PC-3中,使用荧光素酶检测系统检测其活性。结果:DNA测序结果表明成功构建荧光素酶重组载体PGL3-psap,荧光素酶检测显示重组载体在前列腺癌细胞PC-3中有较强活性。结论:本研究成功构建了具有高度活性的PSA启动子荧光素酶报告载体,为进一步研究前列腺癌的诊断和治疗提供了实验基础。     

PD-1核心启动子的获得及活性鉴定

目的:构建PD-1(programmed death receptor 1)全长启动子及不同截短体的报告基因,并对其转录活性进行检测。方法:通过PCR及双酶切方法,从人全血基因组DNA中获得PD-1基因编码序列,包含不同长度碱基的PD-1启动子序列,分别克隆到报告基因pGL3-Basic载体上,构建8个不同长度PD-1启动子的报告基因;用脂质体转染法将8个报告基因分别转染至Jurkat细胞系;采用双萤光素酶报告基因系统评估PD-1启动子的活性。结果:经PCR方法扩增出大小分别为1650、1450、1250、1128、874、674、474和274 bp的不同长度的PD-1启动子序列,测序正确(与GenBank报道一致),酶切鉴定正确;瞬时转染Jurkat细胞系后经报告基因检测,8个启动子均具有转录活性。结论:构建了PD-1启动子的报告基因,并证实均有转录活性,且以pGL3-1128活性最高,为PD-1的核心启动子,为进一步研究PD-1的转录调控奠定了实验基础。     

CKLFSF1基因与CKLFSF2基因间存在的顺式作用元件

探讨趋化素样因子超家族成员 1,2基因 (CKLFSF1基因与CKLFSF2基因 )间的短序列对其下游基因表达的调控作用 .运用PCR技术扩增CKLFSF1基因与CKLFSF2基因间的序列 ,将此片段插入含有萤光素酶 (luciferase)报告基因载体上 .以磷酸钙介导基因转染技术 ,将重组质粒以及阴性和阳性对照组质粒转染到HeLa细胞 ,进行瞬时表达分析 .在pGL3 Basic质粒中的报告基因萤光素酶无表达 ,但将CKLFSF1与CKLFSF2基因间的序列插入到启动子上游或下游后 ,显著抑制其下游基因的表达 ,萤光素酶活性明显降低 .结果提示 ,CKLFSF1与CKLFSF2基因间的序列不具有启动子活性 ,但是该序列对其下游基因表达具有负调控作用     

小鼠Lrp5基因启动子的克隆及功能分析

为分析小鼠LDL受体相关蛋白 5 (Lrp5 )基因启动子的结构与功能 ,采用DNA重组技术 ,构建了 7种含小鼠Lrp5基因启动子荧光素酶报告基因表达体系 ,分别为 :pGL3 10 3(- 10 3bp～ + 132bp) ,pGL3 30 3(- 30 3bp～ + 132bp) ,pGL3 4 99(- 499bp～ + 132bp) ,pGL3 70 8(- 70 8bp～ + 132bp) ,pGL3 90 9(- 90 9bp～ + 132bp) ,pGL3 10 34(- 10 34bp～ + 132bp ) ,pGL3 12 2 9(- 12 2 9bp～ + 132bp) .以pRL TK为内参照质粒 ,瞬时转染成骨细胞株 (U2OS )及非成骨细胞株 (COS 7) ,收集细胞测定荧光素酶相对表达活性 .7种荧光素酶表达质粒在 2种细胞中表达无显著差异 ,即在所分析的小鼠Lrp5基因的 136 1bp(- 12 2 9bp～ + 132bp)范围内 ,不存在成骨细胞特异的表达元件 ;而且 7种表达质粒在 2种细胞中呈现相似的变化趋势 ,pGL3 10 3表达活性最高 ,pGL3 12 2 9表达活性显著降低 .表明小鼠Lrp5基因转录所必需的基本启动子序列在 - 10 3bp～ + 1bp范围内 ,- 10 34bp～ - 12 2 9bp之间的 195bp片段内可能含有负调控元件 .