TOX3基因RNAi慢病毒载体的构建及对乳腺癌ZR-75-1细胞增殖的影响

旨在构建TOX3基因RNAi慢病毒载体并观察其对人乳腺癌ZR-75-1细胞增殖能力的影响。针对TOX3基因设计干扰靶序列,构建载体,测序正确后进行慢病毒包装及滴度测定。转染ZR-75-1细胞,荧光显微镜下观察表达GFP的细胞数目,实时荧光定量PCR及Western blot实验验证转染后ZR-75-1细胞中TOX3 mRNA和蛋白的表达。MTT及平板单克隆实验检测TOX3对ZR-75-1细胞增殖能力的影响。结果显示,各组载体序列正确,病毒滴度均2×108 TU/mL,表达GFP细胞数目均可达95%以上。各干扰组TOX3 mRNA及蛋白表达水平均降低,其中TOX3-shRNA-3组干扰效果最佳,转染后ZR-75-1细胞的增殖和单克隆形成能力下降。成功构建TOX3基因的RNAi慢病毒载体,沉默TOX3后ZR-75-1细胞的增殖能力下降。     

RNA干扰NUP88基因对人乳腺癌MCF-7细胞生长及侵袭力的影响

目的： 构建重组慢病毒介导的NUP88-shRNA载体,通过RNAi技术分别观察沉默NUP88后对MCF-7增殖,粘附,侵袭和转移情况的影响,为乳腺癌的临床基因治疗寻找新的靶点。方法： 构建NUP88重组慢病毒表达载体,包装后检测滴度,以最佳复感染指数转染乳腺癌MCF-7细胞,利用RT-PCR和Western blot检测各组MCF-7细胞中mRNA和蛋白的表达效率;MTT法和流式细胞仪检测法,检测NUP88基因被干扰后对MCF-7细胞增殖和凋亡的影响;细胞侵袭实验检测NUP88基因被干扰后对MCF-7侵袭力的影响。结果 四组病毒及一组阴性对照均构建成功,滴度均为4E+8TU/ml;RT-PCR和Western blot检测,结果表明：经NUP88-shRNA转染的MCF-7细胞组NUP88 mRNA和蛋白质的表达与经阴性转染组和空白MCF-7细胞组相比,差异明显具有统计学意义（P<0.01）;测定NUP88-shRNA1组沉默效率最高,沉默率可达到86%;MTT法结果表明：实验组经NUP88-shRNA1慢病毒转染后细胞增殖程度显著减少,与空白组和对照组相比有显著性差异（P<0.05）。流式细胞仪检测三组MCF-7细胞凋亡结果表明：实验组经慢病毒转染后细胞凋亡率显著增加,与对照组和空白组相比有显著性差异（P<0.05）;细胞侵袭实验表明：在肿瘤细胞常规培养24h后,实验组与空白组和阴性对照组比较,穿膜细胞数量明显减少,具有显著性差异（P<0.05） 结论： NUP88重组慢病毒可以通过RNAi成功抑制MCF-7中NUP88基因的表达,并能显著抑制其增殖及远处的侵袭能力。     

AKT2基因短发夹结构RNA慢病毒载体的构建及鉴定

目的：构建丝/苏氨酸蛋白激酶2（AKT2）基因RNA干扰（RNAi）慢病毒载体。方法：利用公用网站按照RNAi序列设计原则,设计RNAi靶点序列并合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经MluI和ClaI进行酶切后的PLVTHM载体连接产生shRNA慢病毒载体。应用shRNA慢病毒载体转染293T细胞及U87细胞,测定病毒滴度,流式细胞仪测定U87细胞的转染效率,PCR及Western blot鉴定AKT2基因在U87细胞中的下调作用。结果：成功构建了shRNA-AKT2慢病毒载体,经测序与设计合成的靶向链完全一致。荧光显微镜下观察293T细胞感染效率大于90%,病毒滴度为3.59×107TU/ml;流式细胞仪测定对AKT2细胞的转染效率为86.93%。PCR测定shRNA载体感染U87细胞后AKT2的干扰效率为68%。Western Blot结果显示该慢病毒载体对AKT2的表达有较为显著的敲减作用。结论：成功构建了人胶质瘤细胞株AKT2基因RNAi慢病毒载体,为后续的体内外功能学试验创造了条件。     

EGFL7基因RNAi慢病毒表达载体的构建及鉴定（英文）

目的:构建人类表皮生长因子域7(EGFL7)基因RNA干扰(RNAi)重组慢病毒表达载体。方法:参照小分子干扰RNA的设计原则,应用Oligo Designer 3.0软件设计三条靶向人EGFL7基因的RNA干扰序列(h EGFL7-RNAi),并将其分别插入含有绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒载体pLV3中,获得重组质粒,与包装质粒pRsv-REV、pMDlg-pRRE和pMD2G共同转染293T细胞,包装产生重组慢病毒,培养72 h后,应用qRT-PCR检测慢病毒感染人脐静脉内皮细胞(HUVEC)后靶基因mRNA的水平,以评价其基因沉默效果。结果:筛选出3条人EGFL7基因的RNAi序列,分别包装出重组慢病毒,其滴度分别为1×10~8、2×10~8和5×10~8TU/mL,将其转染入HUVEC后,EGFL7mRNA表达均受到明显抑制(P0.05)。结论:成功筛选出三条针对人EGFL7基因的RNAi有效靶序列,并成功构建重组慢病毒表达载体,证明该序列可沉默HUVECs中EGFL7基因的表达。     

SGK3基因RNAi慢病毒载体的构建及其对乳腺癌MB-474细胞增殖和凋亡的影响

旨在构建SGK3基因RNAi慢病毒表达载体,观察其对人乳腺癌细胞MB-474增殖和凋亡的影响。构建靶向SGK3的shRNA序列慢病毒载体,将其转染至人乳腺癌MB-474细胞以沉默SGK3基因,Real-time PCR、Western bloting方法检测MB-474细胞SGK3 mRNA及蛋白表达,MTT法和流式细胞术检测SGK3基因沉默对MB-474细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响。测序结果显示,成功构建4组SGK3基因RNAi慢病毒表达载体,经293T细胞包装,病毒滴度为(3-8)×108 TU/m L;将慢病毒转染MB-474细胞后,Real-time PCR、Western bloting结果显示,干扰组SGK3的表达水平较对照组均降低,且PGC-LV3-SGK3-1序列对其干扰效果最佳,SGK3基因沉默可抑制MB-474细胞增殖、促进凋亡,但其对细胞周期进程无明显影响。成功构建靶向SGK3基因的RNAi慢病毒载体,SGK3基因沉默可影响乳腺癌细胞增殖和凋亡等生物学行为。     

短发夹RNA慢病毒载体稳定抑制NLRP3表达的HepG2细胞的构建

目的:构建针对NLRP3基因的短发夹RNA(sh RNA)慢病毒表达载体,在Hep G2细胞中鉴定该载体对NLRP3的抑制效果。方法:设计针对NLRP3基因的sh RNA序列,将其插入慢病毒表达载体p WPT-U6-sh RNA-CMV-GFP中,将载体与包装质粒ps PAX2、p MD2.G共转染293T细胞,进行病毒包装;得到的病毒原液浓缩后系列稀释为9个浓度递减的病毒液,分别转染293T细胞后进行滴度测定;用获得的慢病毒液感染人肝癌细胞系Hep G2,获得稳定沉默NLRP3的细胞株;利用实时定量PCR和Western印迹检测稳定细胞株中NLRP3的沉默效应。结果:构建了具有沉默效应的慢病毒干扰载体;稀释法测定干扰病毒滴度为2×108TU/m L;实时定量PCR和Western印迹实验均证实慢病毒转染后,细胞株中NLRP3表达水平明显降低。结论:构建了人NLRP3基因特异性慢病毒干扰载体,获得NLRP3基因稳定干扰的Hep G2细胞株。     

AKT2 基因短发夹结构RNA 慢病毒载体的构建及鉴定

目的:构建丝/苏氨酸蛋白激酶2(AKT2)基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体。方法:利用公用网站按照RNAi序列设计原则,设计RNAi靶点序列并合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经MluI和ClaI进行酶切后的PLVTHM载体连接产生shRNA慢病毒载体。应用shRNA慢病毒载体转染293T细胞及U87细胞,测定病毒滴度,流式细胞仪测定U87细胞的转染效率,PCR及Western blot鉴定AKT2基因在U87细胞中的下调作用。结果:成功构建了shRNA-AKT2慢病毒载体,经测序与设计合成的靶向链完全一致。荧光显微镜下观察293T细胞感染效率大于90%,病毒滴度为3.59×107TU/ml;流式细胞仪测定对AKT2细胞的转染效率为86.93%。PCR测定shRNA载体感染U87细胞后AKT2的干扰效率为68%。Western Blot结果显示该慢病毒载体对AKT2的表达有较为显著的敲减作用。结论:成功构建了人胶质瘤细胞株AKT2基因RNAi慢病毒载体,为后续的体内外功能学试验创造了条件。     

Noggin基因沉默表达载体的构建及效果评价

目的构建慢病毒介导的Noggin RNAi干扰序列,并分析这些干扰序列对Noggin基因的沉默效果。方法针对目的基因Noggin的m RNA设计四条干扰序列,并将这些序列连接到Lenti-KD慢病毒载体,将重组质粒瞬时转染HEK-293T包装细胞,获得重组慢病毒。将重组病毒感染MC3T3-E1细胞,利用puromycin进行筛选,获得稳定表达细胞系。通过实时荧光定量PCR和Western blot技术分析不同干扰序列的干扰效果。结果实时荧光定量PCR结果显示,四种干扰序列对Noggin基因的表达都有一定的沉默效果,但只有sh Noggin-1(P0.01)对其表达影响显著。Western blot结果显示,四种干扰序列中只有sh Noggin-1(P0.01)对Noggin的表达蛋白具有显著的降低作用。结论获得了一种Noggin基因的干扰序列,该序列能够干扰Noggin基因m RNA的稳定性,从而影响蛋白的表达。该干扰序列可以用于部分敲除Noggin基因,从而用于研究Noggin基因的功能。     

p300基因小干扰RNA慢病毒载体的构建及其对乳腺癌ZR75-1细胞的影响

目的:构建p300基因的小干扰RNA(siRNA)慢病毒表达载体,检测其对p300蛋白表达的干扰,以及对乳腺癌细胞ZR75-1生长的影响。方法:利用RNA干扰(RNAi)技术设计并合成针对p300基因的siRNA,并将其克隆到siRNA表达载体pSIH-H1上,经酶切和测序验证,用293T人胚肾细胞包装p300 siRNA慢病毒,感染乳腺癌细胞ZR75-1,建立敲低p300表达的稳定细胞株,通过实时定量PCR和Western印迹检验RNAi的干扰效果,利用细胞生长实验检测p300 siRNA对ZR75-1细胞生长的影响。结果:酶切和测序证明构建了p300 siRNA真核表达载体;实时定量PCR和Western印迹证明构建的siRNA能有效抑制p300基因的表达,并建立了敲低p300表达的稳定细胞株;细胞生长实验证实p300 siRNA可有效促进ZR75-1细胞的生长。结论:构建了p300基因的siRNA真核表达载体,转染细胞后能有效抑制p300基因的表达,且能促进ZR75-1细胞的生长,表明构建的p300 siRNA具有功能。     

CEP55慢病毒表达载体构建和U251-CEP55细胞株的建立

目的:构建CEP55慢病毒表达载体,建立稳定表达CEP55的人脑胶质瘤U251细胞株。方法:使用PCR扩增方法将CEP55基因序列进行扩增,转入质粒中,并整合到载体上,构建重组质粒GV358-CEP55载体。与p Helper 1.0和p Helper 2.0质粒共转染293T细胞使其产生慢病毒,以GV358空载体包装的慢病毒作为对照。显微镜观察绿色荧光蛋白GFP表达强度,确定慢病毒的感染效率。采用病毒梯度稀释法测定病毒滴度。慢病毒感染人胶质瘤细胞株U251后,经嘌呤霉素筛选出稳定表达CEP55基因的细胞株U251-CEP55。q RT-PCR和Western blot两种方法分别检测CEP55 m RNA及蛋白的表达。结果:测序证实慢病毒表达载体GV358-CEP55构建成功;转染293T细胞获得高滴度的病毒。病毒感染U251细胞后,使用嘌呤霉素筛选得到稳定转染细胞株U251-CEP55;q RT-PCR和Western blot方法分别检测后发现,U251-CEP55细胞株中CEP55 m RNA和蛋白水平的表达明显高于对照组。结论:成功构建CEP55慢病毒表达载体,获得稳定表达CEP55的人胶质瘤U251细胞株,为CEP55基因功能的探究给予了一定的实验基础。     

Investigation of the mechanism of temperature sensitivity of the electroreceptors of ampullae of lorenzini

In experiments on Black Sea skates (Raja clavata), the potential of the receptor epithelium of the ampullae of Lorenzini and spike activity of single nerve fibers connected to them were investigated during electrical and temperature stimulation. Usually the potential within the canal was between 0 and –2 mV, and the input resistance of the ampulla 250–400 k. Heating of the region of the receptor epithelium was accompanied by a negative wave of potential, an increase in input resistance, and inhibition of spike activity. With worsening of the animal's condition the transepithelial potential became positive (up to +10 mV) but the input resistance of the ampulla during stimulation with a positive current was nonlinear in some cases: a regenerative spike of positive polarity appeared in the channel. During heating, the spike response was sometimes reversed in sign. It is suggested that fluctuations of the transepithelial potential and spike responses to temperature stimulation reflect changes in the potential difference on the basal membrane of the receptor cells, which is described by a relationship of the Nernst's or Goldman's equation type.I. P. Pavlov Institute of Physiology, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. I. M. Sechenov, Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. Pacific Institute of Oceanology, Far Eastern Scientific Center, Academy of Sciences of the USSR, Vladivostok. Translated from Neirofiziologiya, Vol. 12, No. 1, pp. 67–74, January–February, 1980.