AKT2 基因短发夹结构RNA 慢病毒载体的构建及鉴定

目的:构建丝/苏氨酸蛋白激酶2(AKT2)基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体。方法:利用公用网站按照RNAi序列设计原则,设计RNAi靶点序列并合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经MluI和ClaI进行酶切后的PLVTHM载体连接产生shRNA慢病毒载体。应用shRNA慢病毒载体转染293T细胞及U87细胞,测定病毒滴度,流式细胞仪测定U87细胞的转染效率,PCR及Western blot鉴定AKT2基因在U87细胞中的下调作用。结果:成功构建了shRNA-AKT2慢病毒载体,经测序与设计合成的靶向链完全一致。荧光显微镜下观察293T细胞感染效率大于90%,病毒滴度为3.59×107TU/ml;流式细胞仪测定对AKT2细胞的转染效率为86.93%。PCR测定shRNA载体感染U87细胞后AKT2的干扰效率为68%。Western Blot结果显示该慢病毒载体对AKT2的表达有较为显著的敲减作用。结论:成功构建了人胶质瘤细胞株AKT2基因RNAi慢病毒载体,为后续的体内外功能学试验创造了条件。     

miR-448-3p通过调节KLF5的表达抑制颅内动脉瘤进展

目的:明确mi R-448-3p对颅内动脉瘤发展的影响。方法:我们通过结扎左侧肾动脉和左侧颈总动脉的方法建立大鼠IA模型;qRT-PCR用于检测mi R-448-3p表达;qRT-PCR和western blot用于检测KLF5 m RNA和蛋白表达;qRT-PCR和ELISA法用于检测炎症因子水平。结果:我们发现IA诱导大鼠中mi R-448-3p表达下调,而KLF5表达上调。我们发现并鉴定出KLF5是平滑肌细胞中mi R-448-3p的直接靶点。此外,mi R-448-3p处理使得IA诱导4周后动脉瘤大小和瘤腔截面积变小。mi R-448-3p处理保护了IA诱导后的壁厚比,抑制了巨噬细胞浸润。IAs引起KLF5表达显著增加,被mi R-448-3p处理后表达显著降低。我们还发现mi R-448-3p在脂多糖诱导的RAW 264.7巨噬细胞中具有抗炎作用。脂多糖促进KLF5、MMP2、MMP9的表达水平,但却被mi R-448-3p所抑制。结论:研究结果表明,mi R-448-3p可以抑制IA的进展,其机制可能是通过下调KLF5的介导的炎症反应。     

AKT2基因短发夹结构RNA慢病毒载体的构建及鉴定

目的：构建丝/苏氨酸蛋白激酶2（AKT2）基因RNA干扰（RNAi）慢病毒载体。方法：利用公用网站按照RNAi序列设计原则,设计RNAi靶点序列并合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经MluI和ClaI进行酶切后的PLVTHM载体连接产生shRNA慢病毒载体。应用shRNA慢病毒载体转染293T细胞及U87细胞,测定病毒滴度,流式细胞仪测定U87细胞的转染效率,PCR及Western blot鉴定AKT2基因在U87细胞中的下调作用。结果：成功构建了shRNA-AKT2慢病毒载体,经测序与设计合成的靶向链完全一致。荧光显微镜下观察293T细胞感染效率大于90%,病毒滴度为3.59×107TU/ml;流式细胞仪测定对AKT2细胞的转染效率为86.93%。PCR测定shRNA载体感染U87细胞后AKT2的干扰效率为68%。Western Blot结果显示该慢病毒载体对AKT2的表达有较为显著的敲减作用。结论：成功构建了人胶质瘤细胞株AKT2基因RNAi慢病毒载体,为后续的体内外功能学试验创造了条件。