血清和糖皮质激素调节蛋白激酶2α过表达通过Wnt/β-Catenin信号通路抑制肝癌细胞株BEL7402增殖

血清和糖皮质激素调节蛋白激酶(SGK)家族参与调节生长因子和激素的信号转导.为了研究SGK家族成员SGK2α在细胞中的功能,构建了真核表达质粒pEGFP-N1-SGK2α并瞬时转染HEK293细胞,通过激光共聚焦显微镜观察发现融合蛋白SGK2α-GFP主要定位于细胞浆,免疫共沉淀实验发现SGK2α与糖原合成激酶3β(GSK3β)存在相互作用.利用PCDNA6-V5-HisB-SGK2α质粒转染肝癌BEL7402细胞,建立稳定表达SGK2α蛋白的细胞系,通过细胞增殖实验发现,SGK2α的过表达使BEL7402细胞生长速度减慢、细胞倍增时间延长.裸鼠成瘤实验发现,与对照组细胞相比表达SGK2α的BEL7402细胞在裸鼠中的成瘤能力明显降低.免疫印迹实验证实,SGK2α的过表达不影响GSK3β的表达,但却使β-catenin和Cyclin D1的表达下调.提示影响Wnt/β-catenin信号通路关键分子的表达可能是外源性SGK2α蛋白过表达抑制BEL7402细胞增殖的分子机制.     

胰高血糖素样多肽-1拮抗2型糖尿病胰岛细胞凋亡损伤

胰高血糖素样多肽-1（glucogen like peptide 1, GLP-1）在胰岛素分泌过程中扮演重要角色,并在改善β细胞功能方面有着令人瞩目的效应,但有关其作用机制尚需更深入研究。本研究探讨GLP-1对2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus, T2DM）大鼠模型胰岛细胞损伤的影响,观察GLP-1在T2DM大鼠胰岛细胞凋亡损伤机制中所发挥的作用。HE染色结果发现,糖尿病大鼠胰岛损伤。ELISA结果表明,糖尿病患者和糖尿病大鼠血清中GLP-1表达水平上调。放射免疫结果表明,GLP-1和谷氧还蛋白1（Grx1）促进HIT-T 15细胞分泌胰岛素,Cd抑制胰岛素的分泌。免疫组化结果表明,糖尿病大鼠GLP-1加药处理后,各组与糖尿病组相比,药物提高了Grx1和胰岛素表达水平,降低了胰高血糖素表达水平,同时降低了活性胱天蛋白酶3（caspase-3）的表达。本研究结果提示,GLP-1在肥胖T2DM大鼠胰岛细胞凋亡中起保护作用,同时可调节胰岛素和胰高血糖素水平,其机制可能与Grx1相关     

SGK3基因RNAi慢病毒载体的构建及其对乳腺癌MB-474细胞增殖和凋亡的影响

旨在构建SGK3基因RNAi慢病毒表达载体,观察其对人乳腺癌细胞MB-474增殖和凋亡的影响。构建靶向SGK3的shRNA序列慢病毒载体,将其转染至人乳腺癌MB-474细胞以沉默SGK3基因,Real-time PCR、Western bloting方法检测MB-474细胞SGK3 mRNA及蛋白表达,MTT法和流式细胞术检测SGK3基因沉默对MB-474细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响。测序结果显示,成功构建4组SGK3基因RNAi慢病毒表达载体,经293T细胞包装,病毒滴度为(3-8)×108 TU/m L;将慢病毒转染MB-474细胞后,Real-time PCR、Western bloting结果显示,干扰组SGK3的表达水平较对照组均降低,且PGC-LV3-SGK3-1序列对其干扰效果最佳,SGK3基因沉默可抑制MB-474细胞增殖、促进凋亡,但其对细胞周期进程无明显影响。成功构建靶向SGK3基因的RNAi慢病毒载体,SGK3基因沉默可影响乳腺癌细胞增殖和凋亡等生物学行为。     

长链非编码RNA Linc00673过表达对胃癌MGC-803细胞增殖与凋亡的影响*

目的: 探讨长链非编码RNA Linc00673过表达对胃癌细胞增殖和凋亡的影响及其机制。方法: 将重组慢病毒表达质粒pLVX-Linc00673和对照空载体质粒pLVX-NC在293T细胞中进行慢病毒包装与扩增,将重组慢病毒转染胃癌细胞MGC-803建立稳定过表达 Linc00673的细胞系,实时荧光定量PCR方法检测Linc00673基因的表达; MTT实验和克隆形成实验观察细胞的生长增殖;流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡;qPCR检测细胞周期相关调控基因表达;免疫印迹法检测PI3K/Akt信号通路关键分子及肿瘤增殖相关蛋白的表达。结果: Linc00673在胃癌细胞系MGC-803、BGC-823和AGS中的表达量显著高于正常胃粘膜细胞GES-1(P＜0.05)。建立了稳定过表达Linc00673的MGC-803细胞系,Linc00673的表达量比对照空载体组高200倍。Linc00673过表达促进MGC-803细胞增殖和克隆形成(P＜0.05),抑制细胞凋亡并影响细胞周期G1→S期进程(P＜0.01);Linc00673过表达可影响MGC-803细胞周期调节基因CCNG2、p19和CDK1的表达;免疫印迹结果显示,Linc00673过表达不仅促进PI3K/Akt信号通路关键分子pAKT及其下游靶点NF-κB和Bcl-2蛋白的表达,而且上调肿瘤相关因子β-catenin和EZH2蛋白的表达。结论: Linc00673过表达可能通过PI3K/Akt信号通路促进MGC-803细胞增殖、抑制凋亡。     

过表达长非编码RNA SLC25A25-AS1可抑制HeLa细胞的增殖、迁移和侵袭

长非编码RNA SLC25A25-AS1在结直肠癌的发展中具有肿瘤抑制作用,然而,其在宫颈癌中作用机制有待深入研究。本文研究了宫颈癌和宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia,CIN）病人血清中SLC25A25-AS1的异常表达,并探讨了SLC25A25-AS1在宫颈癌发展中可能的作用机制。采用RT-qPCR检测正常对照组,宫颈癌病人和CIN病人血清中SLC25A25-AS1的表达水平。在体外和体内研究中分析了SLC25A25-AS1在宫颈癌系HeLa细胞中的重要作用。与健康对照组相比,宫颈癌病人血清中的SLC25A25-AS1含量降低。在体外,SLC25A25-AS1的过表达抑制HeLa细胞的增殖、迁移和侵袭。体内裸鼠成瘤实验表明,注射过SLC25A25-AS1过表达的HeLa细胞的裸鼠皮下肿瘤的重量和体积明显小于注射对照细胞的裸鼠（P<0.05）。SLC25A25-AS1在宫颈癌的发生发展中可能发挥重要作用,有望成为宫颈癌的新治疗靶点。     

重组人源Kunitz型蛋白酶抑制剂治疗大鼠脑皮质缺血/再灌注损伤

目的旨在研究人源重组丝氨酸酶抑制剂rh KD/APP治疗大鼠脑皮质缺血/再灌注损伤的临床前景。方法构建大鼠大脑中动脉(MCAO)局灶性脑缺血/再灌注(I/R)的动物模型,分别用三个剂量rh KD/APP(4、8、16 mg/kg)的干预进行临床治疗,设神经保护药物尼莫地平治疗作为阳性对照,各干预治疗组分别进行临床评分、神经病理损伤、脑水肿程度的评估和比较,评价rh KD/APP在大鼠脑缺血/再灌注神经保护的临床疗效。同时,分组检测缺血/再灌注脑皮质的自由基氧化程度的三个指标(抗氧化酶SOD活性、Na+-K+-ATP酶活性、膜脂过氧化产物丙二醇MDA含量)、反映中性粒细胞呼吸爆发的髓过氧化物酶MPO活性、血管内皮表达粘附因子ICAM-1和E-selectin的表达水平以及损伤区神经元凋亡的状况。结果低、中、高剂量组rh KD/APP干预均能改善脑缺血/再灌注损伤大鼠的临床症状、脑水肿和神经病理损伤,且呈一定量效关系。与缺血/再灌注模型组大鼠比较,各个剂量的rh KD/APP干预均能提高损伤区脑组织抗氧化酶SOD和Na+-K+-ATP酶活性,降低丙二醇MDA含量,降低髓过氧化酶MPO活性,下调粘附因子ICAM-1和E-selectin的表达,拮抗受损神经元的凋亡。与尼莫地平治疗组比较,在降低MPO活性上,三个剂量rh KD/APP均显示出显著优势(P0.05)。其余各个检测指标,rh KD/AP干预组与尼莫地平治疗组之间比较,差异无显著性。结论重组人源rh KD/APP丝氨酸酶抑制剂能够对大鼠脑缺血/再灌注神经损伤发挥保护作用,这些保护作用可能通过清除自由基、抑制中性粒细胞激活和炎性损伤,拮抗神经元凋亡等多层面综合完成。因此,人源Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂可成为一个潜在的神经保护药物。     

短期低剂量饮酒后戒断改变雄性大鼠肠道微生物菌群并与焦虑样行为相关

长期规律性饮酒会改变肠道微生物菌群构成,并影响焦虑抑郁样行为。而短期低剂量饮酒后戒断是否对肠道菌群产生影响及其与酒精戒断后焦虑样行为是否有关,尚无系统研究。本研究以SD大鼠为研究对象,将30只雄性大鼠随机分为酒精处理组 (Ethanol-C)、对照组 (Ethanol-0)和酒精戒断组 (Ethanol-2),每组各10只。酒精处理组每d以1次酒精(5 g/kg, 25% V/V)连续灌胃14 d;对照组以等量蒸馏水灌胃,酒精戒断组每d以等量酒精连续灌胃14 d,其后戒断1 d。采集所有实验动物粪便,利用高通量测序方法分析慢性酒精刺激后对大鼠肠道微生物多样性及群落结构的影响,通过旷场实验和高架十字迷宫测定大鼠焦虑样行为,并分析肠道微生物与酒精戒断致焦虑样行为的相关性。肠道微生物分类学分析发现,酒精戒断组大鼠肠道微生物的组成和丰度与对照组和酒精处理组比较均出现明显差异。酒精戒断组肠道微生物Alpha多样性与对照组和酒精处理组无显著差异,而微生物群落结构显著不同。酒精戒断组大鼠的开臂时间百分比和自发活动距离显著降低 (P<0.05),且与拟杆菌属（Bacteroides）、梭杆菌属（Fusobacterium）、大肠杆菌志贺菌（Escherichia-Shigella）显著正相关 (P<0.05),而与瘤胃球菌（Rumenococcus）、毛螺旋菌（Trichospirillum）等菌属显著负相关 (P<0.05)。 本研究结果提示,短期低剂量酒精戒断不影响肠道微生物的Alpha多样性,但能够改变大鼠肠道微生物组成丰度及群落结构,且大鼠酒精戒断后的肠道微生物与大鼠焦虑样行为具有相关性。本研究结果明确了肠道微生物在短期低剂量酒精戒断过程中的变化情况,为酒精戒断致焦虑行为的研究提供新的方向。