水貂阿留申病毒抗体依赖性感染增强作用的可能机制探讨

水貂阿留申病毒(Aleutian mink disease parvovirus,AMDV)主要侵害宿主的单核-巨噬细胞,引起持续性感染。病毒感染后可产生免疫复合物疾病、高γ球蛋白血症和高水平的抗体,抗病毒抗体在体内不能有效地清除病毒,反而通过Fc受体介导的抗体依赖性感染增强作用(Antibody-dependent enhancement,ADE)使感染增强,并造成免疫系统功能紊乱。目前,ADE的可能感染致病机制为①抗体复合物与FcR受体、补体成分C3或C1q、C1qR结合,促进了病毒与细胞的吸附;②免疫复合物通过上调模式识别受体的负调控因子抑制了干扰素介导的抗病毒机制;③通过IL-10的早期活化,抑制机体的先天性免疫抗病毒机制。本文就AMDV ADE作用的几种可能机制以及ADE在致病过程中的作用进行了探讨,以期为ADE的分子机制研究、病毒的致病机理及疫苗设计提供参考。     

一株H5N2亚型鹦鹉源禽流感病毒分子进化分析

2005年在广东进行流行病学调查时分离到一株鹦鹉源禽流感病毒,经鉴定为H5N2亚型禽流感病毒(A/Parrot/Guangdong/268/2005)。该毒株的HA裂解位点附近的氨基酸序列为RETRGLF,只含有一个碱性氨基酸,符合低致病性禽流感病毒的HA裂解位点附近氨基酸序列的分子特征;与H5N2亚型禽流感代表毒株相比,该毒株HA和NA基因的糖基化位点、HA基因的受体结合位点编码区、NA基因的耐药性位点均未发生变异。将该毒株全基因组序列与GenBank已公布的19株H5N2亚型禽流感病毒株的相应序列进行比较分析并绘制系统进化树后发现:其与低致病性禽流感毒株A/Pheasant/NJ/1355/1998(H5N2)-like的亲缘关系最近,位于以A/Chicken/Pennsylvania/1/1983(H5N2)为代表的美洲进化分支。     

水貂肠炎病毒山东株分离鉴定及生物学特性分析

【目的】本研究旨在研究水貂肠炎病毒(mink enteritis virus,MEV)的基因组遗传进化特征。【方法】对采自山东境内水貂养殖场的109份水貂腹泻样品进行MEV的分离和鉴定,利用血凝和血凝抑制试验、多步生长曲线绘制以及蛋白的三级结构模拟等,对分离毒株生物学特性进行分析,通过重叠PCR对分离株进行全基因扩增,使用MegAlign进行序列同源性比对分析,利用DNAMANV6对基因组5’末端和3’末端回文结构进行预测,应用MEGAV6进行遗传进化分析。【结果】共分离得到5株病毒,经电镜观察和间接免疫荧光试验鉴定为MEV毒株,分别命名为MUTQS-1-5,GenBank登录号分别为OK275645、OK275646、OK275647、OK275648和OK275649;各分离株5’-和3’-UTR分别由长回文序列组成,具有典型的细小病毒基因组末端的茎环样结构,NS1和VP2基因的推导氨基酸序列存在多个非同义突变位点,其中NS1蛋白的E/Q545V位氨基酸突变,以及VP2蛋白的F267Y、Y324I位氨基酸突变为首次在MEV上发现;生物学特性分析表明,上述突变并未明显改变病毒的血凝及...     

新城疫分离毒HN基因的分子特性和片段同源相关性

选取国内1997-2005年分离的新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)24株,经蚀斑纯化克隆其血凝素-神经氨酸酶(HN)基因,与在GenBank发表的36株国内外不同时期的NDV毒株,进行氨基酸遗传变异分析,并利用SPSS8.0软件对其不同片段的氨基酸进行同源相关比较。结果显示:国内所有NDV分离毒株氨基酸高度同源,同源性为94.4%-99.4%;与LaSota、Clone30疫苗株等的氨基酸同源性为86.9%-89%;与强毒株F48E9的氨基酸同源性为87.9%-89.9%;与国外NDV的氨基酸同源性为87.2%-96.2%。系统发育分析表明:国内NDV分离毒HN遗传距离较近,而与LaSota、Clone30和F48E9遗传距离较远。国内NDV分离毒均缺乏538-540位糖基化位点。不同片段与全长的氨基酸同源性高度相关,且与前80个氨基酸相关最密切。     

IBV青岛腺胃分离株(SD/97/02)S1蛋白基因的序列测定和分析

参考Genbank上发表的IBV S1纤突蛋白基因序列,设计了一对引物,对鸡传染性支气管炎病毒青岛腺胃分离株(SD/97/02)RNA进行RT-PCR扩增.将PCR产物克隆入pMD18-T载体中进行序列测定和分析.序列分析表明,该毒株的S1基因的G+C%含量较少,为37.0%,存在HindⅢ,BamHI,BgIII,SacI和SalI位点,无EcoRI位点,与其他毒株的同源性在87.02%-94.21%之间,在第154～429nt处为高度的变异区;将基因序列翻译成氨基酸后,假定的S1蛋白由540个氨基酸组成,等电点8.24,在蛋白质内部存在18个Cys,在S1与S2蛋白之间的剪切位点为HRRRR,这与大多数IBV毒株(RRF/SRR)不一样,有三个区域的氨基酸序列高度保守;169～181aa,230～250aa,485～506aa;与其他毒株进行抗原性比较后发现,在该毒株的320～326aa及390～401aa处的抗原表位消失,而在325～345aa、379～389aa处则出现了很强的抗原表位;第438～444aa处,其他IBV毒株(除ZJ971株外)原来存在的强抗原位点在本毒株中消失;在53～65位的氨基酸抗原性与其他毒株相比明显变弱.     

1981～2005年中国H1N1甲型流感病毒血凝素基因的HA1演变特征

为了解1981~2005年我国H1N1甲型流感病毒血凝素基因的HA1演变特征,选取H1N1甲型流感病毒370株,提取病毒RNA,经逆转录和聚合酶链反应扩增HA1并测序,测定的序列用生物信息软件分析,与GenBank中相关序列比较,并对推导的编码氨基酸序列进行基因特性分析。结果表明:HA1氨基酸的变异表现为抗原决定簇4个区均有变异,Sb区和Ca区变化较大;HA1受体结合位点(RBS)的前壁130环的第134位赖氨酸从1991年起在部分毒株HA1序列上开始缺失,以后缺失株逐步增多,自2000年起测定的所有毒株上该氨基酸全部缺失,同时这些缺失株的第137位氨基酸也全部由苏氨酸替换为丝氨酸;糖基化位点从增多到减少,最后稳定在7个;1981~2004年我国H1N1甲型流感病毒血凝素HA1编码的氨基酸在种系发育树上同年代基本呈现集中分布,与时间和地域无关,2005年毒株分成两个分支在时间上有明显差异。     

A(H3N2)亚型流感病毒血凝素基因特性及蛋白结构分析,以南宁市2009～2012年为研究案例

利用生物信息学软件和数据库研究南宁市2009~2012年度A(H3N2)亚型流感病HA基因的遗传变异规律及蛋白结构变化。通过RT-PCR扩增H3N2病毒HA基因并测序,同源比对统计毒株氨基酸位点的差异、构建系统进化树分析进化规律和同源建模分析蛋白结构的变化。系统进化树表明53株HA基因序列被分为4个类群,呈多侧支流行;所有毒株的二硫键和受体结合位点(RBS)高度保守;部分毒株HA在第45位点增加一个糖基化位点,在第144位点丢失一个糖基化位点;HA抗原决定簇氨基酸累计有30个位点发生变异,涉及5个抗原决定簇;HA晶体结构分析抗原决定簇突变位点主要发生在无规则卷曲处,大多数替换的氨基酸种类和性质相同或相似。南宁市A(H3N2)亚型流感病毒株变异活跃,2012年A(H3N2)亚型流感病毒与当年WHO推荐的疫苗株具有较远的进化距离,多数毒株具备了形成新变种的条件,是否形成新的流行株,有待深入研究。     

IBDVvp2基因高变区序列测定与进化分析

本实验采用来源于江苏地区的六株不同鸡传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)毒株,应用RT-PCR法对vp2基因高变区进行了扩增,构建重组质粒pMD18T-vp2,测序.与有代表性的IBDV毒株VP2基因高变区序列进行比较分析,以ClustalX软件进行序列比对,得到基因序列及氨基酸序列同源性,IBDVY3、P2G、P8G、SZ、Y5和W04(6株)IBDV与D6984(荷兰)的同源性达到99.0%以上,与其它一些超强毒株(very virulentIBDV,vvIBDV)的同源性也达到了97.8%以上,并在关键氨基酸位点符合vvIBDV特征,采用Phylip3.5软件分析作出进化树,其结果从分子水平说明六个毒株均为vvIBDV,与欧洲和日本的超强毒株有较近的亲缘关系,而与美洲株的较远,从而为IBDV分子流行病学研究和疫苗的研制提供了科学依据.     

IBDVvp2基因高变区序列测定与进化分析

本实验采用来源于江苏地区的六株不同鸡传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)毒株,应用RT-PCR法对vp2基因高变区进行了扩增,构建重组质粒pMD18T-vp2,测序。与有代表性的IBDV毒株VP2基因高变区序列进行比较分析,以ClustalX软件进行序列比对,得到基因序列及氨基酸序列同源性,IBDV Y3、P2G、P8G、SZ、Y5和W04(6株)IBDV与D6984(荷兰)的同源性达到99．0％以上,与其它一些超强毒株(very virulent IBDV,vvIBDV)的同源性也达到了97．8％以上,并在关键氨基酸位点符合vvIBDV特征,采用Phylip3．5软件分析作出进化树,其结果从分子水平说明六个毒株均为vvIBDV,与欧洲和日本的超强毒株有较近的亲缘关系,而与美洲株的较远,从而为IBDV分子流行病学研究和疫苗的研制提供了科学依据。     

口蹄疫病毒热驯化及生物学特性分析

口蹄疫（Foot and mouth disease, FMD）是一种全球性的、感染偶蹄动物的传染病。病毒衣壳对温度，pH敏感，容易在疫苗生产及储存过程中裂解为免疫原性较低的五聚体，影响疫苗的质量。口蹄疫病毒（Foot and mouth disease virus, FMDV）对热敏感的机制研究对于疫苗抗原稳定性意义重大。本文通过循环热应激驯化方式诱导基因突变向耐热性发展，经噬斑纯化获得了驯化毒株M3,M9和M10。通过多序列比对分析发现驯化毒株P1区发生氨基酸突变，一步生长曲线表明驯化毒株氨基酸突变基本不影响病毒的复制，而驯化毒株相比野生型毒株衣壳耐热性有显著提高。驯化毒株M10单一位点突变（A1013T）增强衣壳稳定性，表明A1013T位点对于O型FMDV毒株衣壳耐热性的重要性，但机制仍待后期进一步阐明。该研究将为制备耐热性的FMD疫苗提供了理论依据。     

PR8F/NS1不同位点突变株对小鼠致病性的比较研究

为了探索NS1不同位点突变对流感病毒毒力的影响以及NS1毒力相关位点的作用机制。分析流感病毒NS1蛋白的毒力相关关键基因区段和关键位点,以实验室保存的H1N1亚型流感病毒PR8F为模板,对其NS1基因的第42、81、149位氨基酸分别进行定点突变。利用反向遗传操作技术,成功拯救出突变毒株PR8F-42、PR8F-81、PR8F-149。将获救病毒接种SPF鸡胚,连续传代5代,至病毒能够稳定扩增后,通过血凝效价分析病毒复制效率。并将获救病毒与PR8F均以106 TCID50/100μL感染BALB/c小鼠,观察各组小鼠临床表现、体重变化及存活率。剖检攻毒后死亡小鼠,观察病理特征,制作肺组织病理切片。并提取小鼠肺脏RNA,通过qPCR检测各组小鼠肺脏的病毒载量。结果表明,PR8F的NS1蛋白第42位氨基酸由丝氨酸(Ser)改变为脯氨酸(Pro)对小鼠的致病性无明显改变。第81位、149位氨基酸突变则都能减弱突变株对小鼠的致病性,进而为研究NS1毒力相关位点的作用机制提供平台。     

貉源阿留申病毒全基因组测序及末端序列分子特征分析

貉源阿留申病毒(Raccoon dog and arctic fox amdoparvovirus,RFAV)是自然感染貉和蓝狐的新种阿留申病毒(Amdoparvovirus),为测序RFAV全基因组序列,预测分析RFAV末端发夹结构序列分子特征。本研究采用分段克隆成功获得3株长4832nt、4827nt、4830nt的RFAV全基因组序列,分别命名为RFAV-Y9J、RFAV-RD15、RFAV-HS-R,利用在线软件预测RFAV末端序列二级结构,并与水貂阿留申病毒(AMDV)末端序列进行同源性比对。结果显示阿留申病毒种间、种内3’末端基因组序列保守性强,均存在116nt的Y型发夹结构;RFAV-Y9J与RFAV-RD15毒株5′末端分别存在310nt、305nt的U型发夹结构,RFAV和AMDV种内5′末端基因组序列保守性强,而种间5′末端基因组序列有较大变异。本研究首次完整测序了RFAV的3′和5′末端序列,为其他种阿留申病毒的末端序列扩增提供一种有效方法,为构建RFAV的全基因组序列感染性克隆奠定了基础。     

南京市2011年乙型流感血凝素基因分子特征分析

[目的]分析2011年南京市乙型流感病毒的血凝素(HA)分子学特征.[方法]选择7株2011年南京市不同时间段有代表性的乙型流感毒株进行HA基因序列测定,通过生物信息学方法对HA分子学特征进行分析.[结果]7株乙型流感毒株分为两个系,4株为Victoria,3株为Yamagata;与2011年度疫苗株相比,Victoria和Yamagata系毒株分别在抗原位点146、197和116、198发生了氨基酸替换;其中197和198位点分别是Victoria和Yamagata毒株的受体结合位点,由于上述位点的替换使得Victoria系/Yamagata系毒株分别在197/196位增加了一个潜在的糖基化位点.[结论]2011年南京市乙型流感Victoria 系和Yamagata系病毒同时存在,Victoria/Yamagata毒株197/198位点的氨基酸替换,值得做进一步的探讨.     

三带喙库蚊中分离的西藏环状病毒全基因序列测定及分析

西藏环状病毒(Tibet orbivirus,TIBOV)是环状病毒属中的新成员,首次分离自中国西藏自治区的圆斑按蚊,本研究首次对从三带喙库蚊标本中分离到的西藏环状病毒(HN11121株)进行全基因组序列测定和分子遗传进化分析。结果显示除第2节段以外,三带喙库蚊分离的HN11121病毒株与从圆斑按蚊分离的西藏环状病毒原始分离株(XZ0906)第1~10节段核苷酸和其编码的氨基酸序列长度相同,核苷酸和氨基酸同源性分别为70.3%(S6)~98.7%(S5)和79.8%(S6)~99.8%(S10);而HN11121病毒株与XZ0906病毒株第2节段核苷酸长度分别为2 850bp和2 838bp,分别编码950和946个氨基酸,核苷酸和氨基酸同源性分别为55.8%和47.1%。病毒VP2蛋白氨基酸位点差异结果显示从三带喙库蚊分离的HN11121病毒与从圆斑按蚊分离的XZ0906相比存在390个氨基酸差异位点。基于HN11121病毒株VP1基因和VP3基因核苷酸序列的系统进化分析结果显示HN11121属于环状病毒属西藏环状病毒,但是从三带喙库蚊分离的HN11121病毒与在圆斑按蚊分离的西藏环状病毒原始分离株(XZ0906)处在不同的进化分支。以上结果提示,从三带喙库蚊分离的西藏环状病毒(HN11121)与从圆斑按蚊分离的西藏环状病毒在病毒基因组和病毒基因组分子遗传进化均存在较大差异,鉴于三带喙库蚊是我国乙脑病毒的主要传播媒介,同时该蚊种也是我国南方广泛存在的蚊虫种类,因此加强三带喙库蚊中西藏环状病毒监测对于了解西藏环状病毒的生物多态性具有重要意义。     

马立克氏病病毒38 kd磷蛋白H19-和T65-抗原表位分析及鸡对该抗原表位点突变病毒的免疫反应

对马立克氏病病毒(MDV)38 kd 磷蛋白(pp38)基因的编码序列的测定表明, 所有在间接荧光抗体试验(IFA)中与单抗H19反应的10个不同致病型MDV毒株, 在第320位碱基为“A”, 相应第107位氨基酸是谷氨酰胺, 而在IFA中不与单抗H19反应的疫苗株CVI988相应位点分别是“G”和精氨酸. 另一方面, 在IFA中能与另一个单抗T65反应的毒株, 在第326位碱基是“G”, 第109位氨基酸是甘氨酸, 而其他不与单抗T65反应的毒株, 相应位点碱基和氨基酸分别是“A”和谷氨酸. 通过比较CVI988及其在pp38基因的第320和326位的单一或双碱基点突变病毒CVI988/rpp38(AG)和CVI/rpp38(AA)对H19和T65的反应性, 证明了在第107和109位的谷氨酰胺和甘氨酸分别对pp38上的H19和T65两个抗原表位起关键作用. 比较CVI988及其点突变株CVI/rpp38(AG)在SPF鸡诱发的抗体反应表明, 接种了点突变株CVI/rpp38(AG)鸡的抗体反应出现得比天然株抗体反应明显延缓且显著降低. 进一步对MDV不同抗原成分的相应抗体水平比较表明, 该功能区内可能存在着第3个特异性抗原表位, 它决定于CVI988株pp38第107位的精氨酸, 而且天然CVI988株及其点突变株诱发的抗MDV抗体水平间的显著差异可能正与这个抗原表位相关.     

新城疫病毒ZJ1株F蛋白裂解位点突变对其融合活性的影响*

新城疫病毒ZJ1毒株是近年来在我国水禽中流行并能引起水禽严重发病和死亡的强毒株,其F蛋白裂解位点有多个碱性氨基酸分布。将该毒株F蛋白裂解位点的112、115和117位碱性氨基酸突变成弱毒株特征的非碱性氨基酸,构建了重组表达质粒pCI-FT。分别将突变前后的F蛋白与该毒株的HN蛋白在COS-1细胞共表达,表明突变前后的F蛋白均有融合活性;分别将突变前后的F蛋白与该毒株的HN蛋白在CEF细胞共表达,表明突变后F蛋白被裂解的活性大大降低。以上研究为下一步在全长cDNA克隆水平上对F蛋白裂解位点氨基酸序列进行相应     

犬冠状病毒南京株M基因的同源重组分析

对来自腹泻犬粪样的犬冠状病毒(CCV)南京株NJ17株及参考株171的M基因进行了克隆、测序,并与GenBank中所有已知CCV毒株及同亚群的猪冠状病毒(TGEV)和猫冠状病毒(FCoV)代表株的M基因进行了同源性比较和系统进化分析,同时对M蛋白的结构和功能进行了预测分析。结果表明,CCV171与近年在中国分离到的CCV毒株V1、V2及大熊猫源的毒株具有98.9%～99.5%的同源性,说明这些毒株可能是来自同一毒株的准种。NJ17与其他中国分离株及国外分离株的同源性为87.0%～91.9%,显示国内可能存在一个相对独立进化的CCV毒株。序列比较发现,所有CCV毒株在可能的同源重组“热点”区内都有一个CTTTAG序列,与鸡传染性支气管炎病毒同源重组模板交换位点附近的特征序列相似。CCVNJ17株M蛋白在N端50氨基酸序列与FCoV791683同源性高,而在后212氨基酸序列与TGEV同源性高,提示该毒株可能在M基因上曾经发生过不同病毒的同源重组。CCVM蛋白的结构及功能预测表明,所有毒株都具有分泌型信号肽,有4个螺旋跨膜区,N末端和C末端均位于膜内。M蛋白的两末端具有较强的抗原性,M蛋白上存在多种功能性氨基酸修饰位点且相对保守。N末端的氨基酸变异很大,但是功能性修饰位点相对保守,提示N末端的功能可能与构象有关。     

犬冠状病毒南京株M基因的同源重组分析

对来自腹泻犬粪样的犬冠状病毒(CCV)南京株NJ17株及参考株1-71的M基因进行了克隆、测序,并与GenBank中所有已知CCV毒株及同亚群的猪冠状病毒(TGEV)和猫冠状病毒(FCoV)代表株的M基因进行了同源性比较和系统进化分析,同时对M蛋白的结构和功能进行了预测分析.结果表明,CCV1-71与近年在中国分离到的CCV毒株V1、V2及大熊猫源的毒株具有98.9%～99.5%的同源性,说明这些毒株可能是来自同一毒株的准种.NJ17与其他中国分离株及国外分离株的同源性为87.0%～91.9%,显示国内可能存在一个相对独立进化的CCV毒株.序列比较发现,所有CCV毒株在可能的同源重组"热点"区内都有一个CTTTAG序列,与鸡传染性支气管炎病毒同源重组模板交换位点附近的特征序列相似.CCV NJ17株M蛋白在N端50氨基酸序列与FCoV 79-1683同源性高,而在后212氨基酸序列与TGEV同源性高,提示该毒株可能在M基因上曾经发生过不同病毒的同源重组.CCV M蛋白的结构及功能预测表明,所有毒株都具有分泌型信号肽,有4个螺旋跨膜区,N末端和C末端均位于膜内.M蛋白的两末端具有较强的抗原性,M蛋白上存在多种功能性氨基酸修饰位点且相对保守.N末端的氨基酸变异很大,但是功能性修饰位点相对保守,提示N末端的功能可能与构象有关.     

2008～2009年珠海市H3N2亚型流感病毒HA1基因特性分析

为了解2008~2009年珠海市H3N2亚型流感病毒HA1基因变异情况,选择珠海市2008~2009年期间不同时间点的经狗肾传代细胞(MDCK)培养分离的H3N2亚型流感毒株20株,提取病毒RNA,通过RT-PCR扩增HA1基因片段,将产物纯化并测序,推导氨基酸序列,进行基因进化特性分析。与同时期的疫苗株比较,2008年珠海市流行的H3N2亚型流感毒株HA1区抗原决定簇的氨基酸位点变异数少于4个;2009年珠海市流行的H3N2亚型流感毒株除09-0056外,HA1区存在5个位于抗原决定簇内的变异氨基酸位点。2008年H3N2亚型流感毒株的HA1区的糖基化位点与疫苗株一致;2009年H3N2亚型流感毒株HA1区丢失第144位糖基化位点。2008~2009年H3N2亚型流感毒株RBS氨基酸序列未见明显变异。与2008年H3N2亚型流感毒株比较,2009年H3N2亚型流感毒株HA1区抗原决定簇内存在多个位点的氨基酸替换。这些说明2008年珠海市流行的H3N2亚型流感病毒不是新变种;2009年流行的H3N2亚型流感病毒为新的变异株,这可能是H3N2亚型流感病毒在2009年6-9月为珠海地区季节性流感流行优势株的原因。