嗜冷嗜酸β-1,4-木聚糖酶及其钙离子依赖型碳水化合物结合模块

【目的】β-1,4-木聚糖酶是木聚糖降解的关键酶之一,嗜冷嗜酸木聚糖酶在功能性低聚木糖的制备中具有重要作用,但相关报道较少。【方法】从太平洋火色杆菌(Flammeovirga pacifica)菌株WPAGA1基因组发掘到一条新型的木聚糖酶序列,经基因合成、质粒构建和表达,并对其进行分离纯化及酶学性质研究。【结果】该木聚糖酶(Xyl4513)具有2个保守结构域,一个属于糖苷水解酶11家族(glycoside hydrolase family 11,GH11)催化模块(Xyl4513-T),另一个属于碳水化合物结合模块(carbohydrate-binding module,CBM) 60家族(CBM4513),这是一种非常罕见的GH11家族木聚糖酶含有CBM的现象。纯化后的Xyl4513最适反应温度和pH值分别为30℃、3.0,这一特性说明Xyl4513为嗜冷嗜酸β-1,4-木聚糖酶;而截短的木聚糖酶Xyl4513-T最适反应温度和pH值分别为20℃、4.0,且催化效率(k_cat/K_m)较前者下降了20%,说明CBM4513对酶稳定性和催化效...     

嗜极性木聚糖酶

木聚糖酶内切水解木聚糖主链的1,4-β-D-糖苷键,木聚糖是植物细胞壁中一种主要的多糖。自然界中木聚糖是多种糖类的复合体,这就使得木聚糖酶呈现多态性和多域性,由此需将繁多的木聚糖酶进行归类。木聚糖酶的催化反应属于双置换机制。在已研究的真菌或细菌性木聚糖酶中,大多数在温和的条件下表现出最佳活性,但有很多在极端环境下生长的生物体,为了适应极端环境而产生嗜极性的酶,其中嗜酸的、嗜碱的、嗜热的木聚糖酶,现在已有广泛的研究。对嗜极性木聚糖酶的研究进展作了论述。     

牦牛瘤胃元基因组文库中木聚糖酶基因的分析

【目的】了解牦牛瘤胃微生物木聚糖酶多样性及其降解特征,为木聚糖降解提供新的基因资源。【方法】根据对已构建的瘤胃微生物元基因组细菌人工染色体(BAC)克隆文库高通量测序结果的注释,筛选其中编码木聚糖酶的基因并进行多样性分析;对其中一个木聚糖酶基因及其连锁的木糖苷酶基因进行克隆表达和酶学性质表征,分析其协同作用。【结果】共筛选到14个木聚糖酶基因,均编码GH10家族木聚糖酶,其氨基酸序列之间的相似性为20.5%-91.3%;其中7个木聚糖酶基因所在的不同的DNA片段(contig)上存在木糖苷酶基因,编码的木糖苷酶属于GH43或GH3糖苷水解酶家族。将其中一对连锁的木聚糖酶(Xyn32)和木糖苷酶基因(Xyl33)分别克隆、表达和纯化。纯化后的木聚糖酶比活为1.98 IU/mg,但不具有阿魏酸酯酶活性;木糖苷酶比活为0.07 U/mg,且具有α-阿拉伯呋喃糖苷酶活性。体外实验证明,木糖苷酶Xyl33对与之连锁的木聚糖酶Xyn32的木聚糖降解具有协同作用。     

嗜热淀粉芽孢杆菌来源β-葡萄糖苷酶的重组表达与酶学性质

【背景】β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21,β-glucosidase),是纤维素分解酶系中的重要组成部分,目前工业上应用的β-葡萄糖苷酶多数来源于植物和真菌,来源于细菌的较少,且应用中还存在酶活力偏低、热稳定性差、反应条件适用范围窄、酶活力易受产物反馈抑制等问题,增加了经济成本。嗜热微生物具有特殊的遗传信息资源,极有可能从中挖掘到酶学性质优良的新型β-葡萄糖苷酶,从而解决工业难题。【目的】从嗜热淀粉芽孢杆菌(Bacillus thermoamylovorans)基因组中挖掘新型β-葡萄糖苷酶基因,通过基因重组、异源表达和蛋白纯化技术制备新型β-葡萄糖苷酶,并探究其酶学性质,为新型β-葡萄糖苷酶在纤维素水解等领域的应用奠定基础。【方法】人工合成新型β-葡萄糖苷酶基因bgl52,构建重组表达质粒pET22b-bgl52,并用电脉冲法转化到大肠杆菌BL21(DE3)中实现可溶性表达,利用Ni-NTA亲和层析纯化得到高纯度的β-葡萄糖苷酶Bgl52。【结果】实现重组表达质粒pET22b-bgl52在大肠杆菌BL21(DE3)中的可溶性表达,并获得β-葡萄糖苷酶Bgl52纯蛋白,蛋白分子量为52 kD,在70°C和pH 6.5条件下表现出最佳活性;以p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside (p NPG)为底物时的比酶活为223.7±5.3 U/mg;K_m为9.3±1.2 mmol/L,V_(max)为270.3±4.3μmol/(min·mg);Bgl52偏好性水解β-1,4糖苷键的底物;Fe~(2+)和Mg~(2+)对酶的激活作用明显,Co~(2+)、Cu~(2+)和SDS可抑制其活性;Bgl52是少有的几种葡萄糖和木糖激活型β-葡萄糖苷酶之一,当反应体系中外源添加0.2 mol/L葡萄糖时可提升活力至2.84倍,外源添加0.4 mol/L木糖时可提升活力至3.24倍,同时Bgl52在生理条件下基本不受产物的反馈抑制。【结论】利用嗜热微生物基因组中蕴藏的遗传信息资源,通过现代生物技术方法,可以从中挖掘到酶学性质优良的β-葡萄糖苷酶,为其在纤维素降解等工业领域的应用奠定基础。     

Leifsonia sp.ZF2019中一种新型耐木糖β-木糖苷酶的表达与特征

【目的】从栀子灰蝶幼虫分离的Leifsonia sp. ZF2019菌株中克隆表达出一种新型β-木糖苷酶Xyl4900,并研究其酶学性质,以期为开发适用于工业生产的β-木糖苷酶提供参考。【方法】采用生物信息学分析技术分析Leifsonia sp. ZF2019菌株的β-木糖苷酶Xyl4900基因并在大肠杆菌中表达了该基因,纯化并研究了其酶学性质。【结果】Xyl4900与GH3家族的β-葡萄糖苷酶同源性高,但带有β-木糖苷酶结构域,可特异性水解对硝基苯基β-D-吡喃木糖苷（p NPX）,是一种新型β-木糖苷酶。酶学特性分析显示,Xyl4900在45℃和pH 7.0的条件下酶活性最高,且在pH 6.0–9.0的范围内孵育14 h,仍保持80%以上的酶活力。除Cu²⁺外,其他金属离子（2.5 mmol/L）对Xyl4900酶活力无明显影响,且对低浓度有机溶剂（5%V/V）有较强耐受性。此外,在20%（W/V） NaCl或100mmol/L木糖溶液中Xyl4900的酶活性仍高于50%,表现出较好的盐和木糖耐受性。动力学参数分析显示,Xyl4900的K_m     

嗜糖黄杆菌β-葡萄糖苷酶的功能及在稀有人参皂苷制备中的应用

【背景】有些稀有皂苷具有较好的药理活性,寻找活性高和专一性好的糖苷酶可能实现稀有皂苷的定向制备。嗜糖黄杆菌中含有丰富且未被表征的糖苷酶基因是寻找新酶的潜在来源。【目的】从嗜糖黄杆菌中发现活性高和专一性好的糖苷酶,用于制备稀有人参皂苷。【方法】重组表达嗜糖黄杆菌中15个假定的葡萄糖苷酶基因,系统研究重组酶的性质和功能,筛选可用于制备稀有皂苷的酶,利用薄层层析法和高效液相色谱法鉴定转化产物。【结果】从嗜糖黄杆菌中获得3种活性较好的β-葡萄糖苷酶,即SA2629、SA0236和SA2851。其中,SA2629具有最高的比酶活(78.7U/mg)和催化效率[kcat=(27.38±1.40)s^-1],且SA2629能同时水解人参皂苷C-20位上的β-1,6-葡萄糖苷键和C-3位直接与苷元相连的葡萄糖苷键。SA2851和SA0236只对C-20位上的β-1,6-葡萄糖苷键具有水解活性,其中SA0236活力高。将SA2629和SA0236与课题组前期获得的一种β-1,2-葡萄糖苷酶分别组合,可以将高含量人参皂苷Rb1完全转化成稀有皂苷CK和F2。【结论】获得了可用于制备稀有人...     

定向引入N-糖基化位点改进黑曲霉β-1,4-内切木聚糖酶热稳定性

【背景】木聚糖是生物圈中仅次于纤维素的第二大多糖,其结构复杂,完全降解需要多种木聚糖酶协同作用。β-1,4-内切木聚糖酶是木聚糖主链水解过程中最关键的酶,已广泛应用于饲料、造纸、能源、食品和医药等行业。但在实际应用中,由于真菌木聚糖酶的热稳定性较差,限制了其在工业中的应用。【目的】提高来源于黑曲霉(Aspergillusniger)的β-1,4-内切木聚糖酶(xynB)热稳定性。【方法】采用氨基酸虚拟突变技术对xynB定向引入一个N-糖基化位点,将虚拟突变后筛选获得的候选突变体和野生型在毕赤酵母SMD1168中表达,并对纯化后的野生型和突变体酶进行酶学性质和稳定性分析。【结果】经虚拟突变和筛选获得5个候选突变体,在毕赤酵母SMD1168中成功表达了4个突变体,其中3个突变体发生了糖基化。突变体和野生型酶均表现出宽范围的酸碱耐受性,且突变体xynB~(A92N/D94T)在pH4.0–11.0条件下的稳定性明显优于野生型;糖基化突变体xynB~(A92N/D94T)、xynB~(G66N/A68T)和xynB~(G66F/D67N/G69T)在温度为60–80°C时热稳定性明显高于野生型,xynB~(G66N/A68T)在80°C保温30 min后的残留酶活比野生型提高了约30%。【结论】本研究方法可为其他来源木聚糖酶和其他工业酶的热稳定分子改造提供参考。     

嗜热脱氮土壤芽孢杆菌β-葡萄糖苷酶的克隆与重组表达及其酶学性质研究

【目的】克隆嗜热脱氮土壤芽孢杆菌中的β-葡萄糖苷酶基因bglB,在E.coli中异源表达,纯化并研究其酶学性质。【方法】利用PCR技术从嗜热脱氮土壤芽孢杆菌的基因组DNA中克隆得到bglB基因,将该基因克隆到表达载体pGEX-2TL上并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,对纯化后的β-葡萄糖苷酶的酶学性质及寡聚状态进行分析。【结果】重组表达的β-葡萄糖苷酶最适温度为65°C,最适pH为7.0,能在pH 5-10、60°C下稳定存在4 h,并能在较高的离子强度(880 mmol/L K+)下发挥其功能。Al3+离子对其有强烈的激活作用,Co2+有一定的抑制作用。最适反应条件下该酶比活力为0.043 IU/mg。该酶具有多种寡聚体形式,这些寡聚体均有β-葡萄糖苷酶活性。【结论】获得一个耐热耐盐的中性β-葡萄糖苷酶,为进一步研究β-葡萄糖苷酶的催化作用机理,提高其热稳定性提供一定的帮助。     

嗜热古菌Thermofilum adornatum来源的高温热激活β-葡萄糖苷酶TaBgl3的原核表达及酶学性质研究

【目的】β-葡萄糖苷酶，又称β-D-葡萄糖苷水解酶，属于纤维素酶类，是一种降解纤维素的关键限速酶。来源于嗜热古菌的β-葡萄糖苷酶已被广泛验证具有酸性高温等特性，已成为高温酶的研究热点之一。本文对尚未报道的来源于嗜热古菌中一种热丝菌（Thermofilum adornatum）的GH3家族的葡萄糖苷酶，进行了原核表达和酶学性质测定，以期找到更优的β-葡萄糖苷酶。【方法】从NCBI数据库中获得了嗜热古菌（T.adornatum）来源的GH3氨基酸序列，构建重组质粒p ET-30a（+）-TaBgl3，并在大肠杆菌（Escherichia coli） BL21（DE3）感受态细胞中诱导表达重组蛋白；采用磁珠纯化，研究其酶学性质。【结果】重组蛋白TaBgl3的分子量为77.0 kDa；酶学性质结果表明，其最适反应条件为80°C和pH 5.0，在70°C保温处理1–4 h，对TaBgl3的酶活力有促进作用，在最适温度80°C处理2 h后，其激活作用更加明显，能提高40%以上的酶活；其在pH 5.0–8.0下37°C保温1 h，仍具有60%以上的活性；底物为对硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷（p NP...     

嗜碱细菌Cellulomonas bogoriensis 69B4T木聚糖酶的表达纯化及性质研究

【目的】对嗜碱细菌Cellulomonas bogoriensis 69B4~T产碱性木聚糖酶进行研究,克隆来源于该菌株的木聚糖酶基因,并对其进行异源表达、纯化及酶学性质的表征,为后续研究碱性木聚糖酶的耐碱机制及应用奠定基础。【方法】采用单因素分析法对菌株产碱性木聚糖酶情况进行研究;通过基因组分析,锚定5个内切木聚糖酶基因,利用同源扩增的方法进行克隆,并在大肠杆菌中重组表达,利用亲和层析对重组酶进行纯化,以木聚糖为底物表征木聚糖酶的酶学性质。【结果】来源于C. bogoriensis 69B4~T的5种木聚糖酶Xyn370、Xyn393、Xyn425、Xyn466和Xyn486均在大肠杆菌内实现了异源表达,并经亲和层析获得纯酶组分,其最适反应温度分别为60、50、40、40、60°C,在50°C范围内保温2h,残余酶活均在90%以上;最适反应p H分别为7.0、8.0、8.0、8.0、9.0,在p H5.0–9.0时具有较好的稳定性;5种重组木聚糖酶对部分金属离子和高浓度盐表现出较好的耐受性,对榉木木聚糖的酶活性最高,均为内切型木聚糖酶。【结论】本研究表达纯化的5种重组木聚糖酶具有耐盐碱的优良特性,且对温度、某些金属离子和化学试剂耐受,为研究木聚糖酶的耐碱机制及工业应用提供了酶源。     

Alkalitalea saponilacus产木聚糖酶的碳源优化及酶学特性

【目的】确定厌氧盐碱细菌Alkalitalea saponilacus产木聚糖酶所需的碳源,优化木聚糖粗酶的提取条件并分析酶学性质。【方法】应用GC技术分析A.saponilacus发酵木聚糖的主要产物;利用二硝基水杨酸法(DNS)测定木聚糖酶活力以获得最优的碳源、提取粗酶的最佳条件及其酶学特性。【结果】A.saponilacus以不同来源木聚糖为底物时,发酵产生的主要产物丙酸含量都在80%以上。若以0.4%(W/V)蔗糖+0.1%(W/V)桦木木聚糖为复合碳源时,木聚糖酶活力是以桦木木聚糖或者蔗糖为单一碳源时的3.2倍。木聚糖酶的酶活力在盐度2%–6%、pH 7.0和55°C达到最佳且在该条件下的酶活力为590 IU/mg。此外,该酶活力在0.2%Tween 20存在时增加,而在5 mmol/L Mg~(2+)和0.2%Triton X-100存在时无显著影响,但在Cu~(2+)、Fe3+和Ni~(2+)等金属离子存在时则被显著抑制。【结论】A.saponilacus发酵主产物丙酸以及生物合成的木聚糖酶在工业生产中具有广泛的应用前景。     

嗜酸嗜热古菌Sulfolobus acidocaldarius编码尿嘧啶DNA糖苷酶表达，纯化与酶学特征

摘要:【目的】嗜高温微生物面临dC脱氨基生成dU损伤的巨大压力,鉴定嗜酸嗜热古菌S.acidocaldarius来源的尿嘧啶DNA糖苷酶(UDG)切除dU损伤的酶学活性。【方法】重组表达来源于S.acidocaldarius的IV和V型UDG,经亲和纯化得到电泳纯重组蛋白。然后利用人工合成的dU(deoxyuracil)修饰寡核苷酸片段作为底物,体外鉴定两种重组UDG 的酶学特性。【结果】来源于S.acidocaldarius的IV和V型重组UDG具有相似的酶学特性。IV型UDG催化效率更高,比活性是V型重组UDG的750倍左右。作为来自嗜热微生物 的蛋白,S.acidocaldarius的IV和V型UDG的最适反应温度为65－75℃。【结论】IV型UDG比V型UDG水解dU碱基和脱氧核糖之间糖苷键的能力更强。     

鉴定隶属于糖苷水解酶13家族(glycoside hydrolase family 13, GH13)的潮滩发光杆菌的β-半乳糖苷酶

【背景】糖苷水解酶13家族(glycoside hydrolase family 13, GH13)是已知最大的α-淀粉酶家族,不含有半乳糖苷酶。【目的】对海洋细菌潮滩发光杆菌(Photobacterium gaetbulicola)的一个蛋白BgalPg进行鉴定。【方法】通过保守位点分析和系统发育树确定BgalPg蛋白的家族分类;通过克隆、表达和纯化测定重组BgalPg蛋白的酶学性质并鉴定功能。【结果】BgalPg的蛋白序列新颖,与已知的碳水化物酶无同源性。序列分析结果表明该蛋白具有GH13家族的典型特性,并且隶属于GH13＿38亚家族。BgalPg对α-淀粉酶家族酶的相关底物均无催化活性,却能水解含有β-半乳糖苷键的底物p NP-β-Gal [(2.8±0.4) U/mg]和o NP-β-Gal [(1.4±0.3) U/mg],并且能水解乳糖[(0.40±0.01) U/mg],表现出典型的β-半乳糖苷酶活性。同时,该酶在pH 7.0–8.5稳定性好,60℃的半衰期为1.5 h。【结论】发现隶属于GH13家族的β-半乳糖苷酶。     

枯草芽孢杆菌产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的响应面优化

【目的】采用响应面法(RSM)优化枯草芽孢杆菌5 L发酵罐产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的发酵条件。【方法】利用Box-Behnken设计和方差分析。【结果】获得最佳发酵条件为:转速、通气量和培养基pH分别为500 r/min、1.05 vvm和5.08,发酵时间仅为22 h产β-1,3-1,4-葡聚糖酶活力达2 294.4 U/mL。【结论】实验结果表明响应面法优化5 L发酵罐发酵产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的条件合理可行。     

疏绵状嗜热丝孢菌外切β-葡聚糖酶的基因克隆与酶学特征

【目的】疏绵状嗜热丝孢菌是一种嗜热丝状真菌,具有合成与分泌多种耐热酶的能力,从中找寻酶活高、耐热性能优良的β-葡聚糖酶。【方法】对疏绵状嗜热丝孢菌其中一个外切β-葡聚糖酶的编码基因gln B进行克隆,并在毕赤酵母GS115中表达。【结果】在摇瓶水平上重组菌的产酶活为11.5 U/m L,重组酶在SDS-PAGE中的大小约为48 k D。重组Gln B最适作用温度为65°C,最适作用p H为5.0;在低于50°C或p H 3.0-10.0之间具有良好稳定性。重组酶水解海带三糖,首先生成单糖和二糖,延长酶作用时间,可以进一步将其中的二糖部分水解为单糖。【结论】疏绵状嗜热丝孢菌来源的重组酶Gln B为外切β-葡聚糖酶,具有较好的耐热性能和p H稳定性。     

青海可可西里嗜碱芽胞杆菌资源调查

【目的】了解可可西里嗜碱芽胞杆菌资源多样性及产酶多样性,为芽胞杆菌功能资源挖掘和菌剂开发提供基础。【方法】采用Horikoshi I培养基,通过可培养法分离青海可可西里土壤中的嗜碱芽胞杆菌,利用16S r RNA基因序列初步鉴定分离获得的芽胞杆菌。采用透明圈法分析分离菌株的产蛋白酶、纤维素酶及木聚糖酶活性。【结果】从青海可可西里土壤中共分离获得66株嗜碱芽胞杆菌,根据16S r RNA基因序列相似性分析,发现它们隶属于6个属22个种,分别为芽胞杆菌属(Bacillus)、纤细芽胞杆菌属(Gracilibacillus)、喜盐芽胞杆菌属(Halobacillus)、咸海鲜芽胞杆菌属(Jeotgalibacillus)、类芽胞杆菌属(Paenibacillus)和嗜冷芽胞杆菌属(Psychrobacillus),其中以芽胞杆菌属(Bacillus)为优势属。2株嗜碱芽胞杆菌与它们最近匹配模式菌株的16S r RNA基因序列相似性为97.00%和98.65%,为潜在新种。三种酶活检测结果表明产酶菌株约占总分离菌株的95.00%,其中55株具有产蛋白酶活性,27株具有产纤维素酶活性,8株能够产木聚糖酶。【结论】青海可可西里蕴藏着较丰富的嗜碱芽胞杆菌资源及丰富的产酶资源,为后续嗜碱芽胞杆菌的挖掘提供理论基础。     

毕赤酵母表达的嗜热蓝状菌β-葡萄糖苷酶N-糖基化修饰的作用与功能

【目的】研究N-糖基化对来源于嗜热蓝状菌β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,Bgl3A)的酶学性质影响。【方法】采用定点突变技术构建了3个去N-糖基化的突变体T44A、S228A、S299A,并分别在毕赤酵母GS115中表达纯化。【结果】与野生型Bgl3A相比,突变体S228A分泌蛋白产量极低,仅能微量检测到p NPG活性;突变体T44A和S299A的最适pH和最适温度没有改变,分别为4.0和75°C,但二者的T_m值和70°C下的热稳定性都明显优于野生型。以p NPG为底物时,突变体S299A和T44A的催化效率分别降低了14.5%和70.0%;以纤维二糖为底物时,T44A的催化效率基本不变,而S299A的催化效率提高了1.1倍。【结论】Bgl3A不同位点的N-糖基化修饰对酶的分泌和酶学性质的影响具有明显差异。其中,N226位的N-糖基化在维持酶的表达和功能方面至关重要,而去除N297位点的N-糖基化可以提高酶的热稳定性及对纤维二糖的催化效率。     

脂环酸芽孢杆菌D-1的耐盐内切葡聚糖酶基因克隆、表达与酶学性质北大核心CSCD

【目的】克隆温泉中嗜热嗜酸的脂环酸芽孢杆菌D-1(Alicyclobacillus tengchongensis CGMCC1504)的内切葡聚糖酶基因gluE1,并对该酶进行序列分析和重组酶的酶学特性分析。【方法】通过全基因组测序获得gluE1全长,并对其氨基酸序列(GluE1)进行分析。将gluE1重组到载体p EASY-E2中并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达,利用组氨酸标签纯化GluE1并进行酶学性质分析。【结果】gluE1与NCBI数据库中GH5的内切葡聚糖酶具有较高的相似性,全长1020 bp,GC含量50.5%,编码339个氨基酸(40.45 k Da)。GluE1与数据库中序列的最高一致性为97%,与其余纤维素酶的一致性<60%。GluE1可水解CMC-Na、可溶性淀粉和大麦β-葡聚糖,表观最适pH为6.5,pH 5.0–10.0稳定并维持60%以上的酶活性。GluE1的表观最适温度为55℃,在37℃下稳定。在55℃ pH 6.5条件下,GluE1对大麦β-葡聚糖的K_m、V_(max)和k_(cat)分别为8.58 mg/mL、416.67 U/mg和280.90 s^(–1)。GluE1受Ag^+、Hg^(2+)及SDS抑制,β-巯基乙醇、Pb^(2+)、Mg^(2+)、Ca^(2+)和Na^+对GluE1有微弱的促进作用,NaCl对GluE1的影响不大,加入30%的NaCl,仍有64%以上的酶活性;经30%的NaCl在37℃下处理60 min,仍能保持93%以上的活性。【结论】首次报道从Alicyclobacillus属的细菌中克隆得到内切葡聚糖酶基因并对其酶学性质进行研究,GluE1具有良好的pH稳定性和有较强的耐盐性,可能具有更大应用潜力。     

嗜酸热脂环酸杆菌中甘露聚糖酶活性位点的确立

【目的】通过定点突变确定嗜酸热脂环酸杆菌中甘露聚糖酶的活性催化位点。【方法】根据序列比对和GH53家族的结构信息选择可能的催化活性位点,利用重叠PCR法构建定点突变体,采用薄层层析(TLC)法和3,5-二硝基水杨酸(DNS)法检测各酶蛋白活性。【结果】通过重叠PCR法成功构建了7个位点的突变体,其中第150和159位的氨基酸突变对活性改变甚少或几乎没有,而第151和231位谷氨酸的羧基基团的改变以及双位点突变体E2Q则导致其对各种底物催化活性的丧失,说明位于β4和β7折叠的C末端的E151和E231的羧基基团作为功能基团参与了催化反应。【结论】E151和E231分别是新型甘露聚糖酶AaManA的酸碱催化位点和亲核催化位点。     

嗜热真菌耐热木聚糖酶的产酶条件和酶谱分析*

嗜热真菌Thermomyces lanuginosus CBS288.54-M18耐热木聚糖酶的产酶条件和酶谱分析结果表明：玉米芯水不溶木聚糖相对于其它来源木聚糖为最佳碳源,而酵母提取物和蛋白胨作为复合氮源时效果最好。培养基最适初始pH值为7．0,最适培养温度为50℃。在最适条件下发酵所产木聚糖酶活力最高达1.834u／mL。另外,SDS-PAGE和酶谱分析(变性和非变性状态下)结果都表明该菌只产生一种分子量约为26kD的G/11族木聚糖酶。