一种来源于青霉的新的α-半乳糖苷酶的分离纯化及其酶学性质

从丝状真菌中筛选到一株产α-半乳糖苷酶的菌株F63,对该菌株进行了形态观察和18SrDNA序列分析,该菌株属于青霉属。采用硫酸铵沉淀、阴离子交换层析和分子筛层析等方法分离纯化了该菌株的一种α-半乳糖苷酶。经过聚丙烯酰胺凝胶电泳,此酶蛋白的分子量约为82kDa。该α-半乳糖苷酶反应的最适pH为5.0,最适温度为45℃。此α-半乳糖苷酶的热稳定性在40℃以下,pH稳定性为pH5.0-6.0。与已报道的α-半乳糖苷酶的活性都受到Ag 的强烈抑制不同的是,该α-半乳糖苷酶受Ag 的抑制作用不显著。以pNPG为底物的Km值为1.4mmol/L和Vmax=1.556mmol/L.min-1.mg-1。该酶可以有效降解蜜二糖、棉子糖和水苏糖,但不能降解末端含α-半乳糖苷键的多糖。通过利用质谱技术对纯化的α-半乳糖苷酶进行鉴定以及内肽的N端测序证明该蛋白为一种新的α-半乳糖苷酶。     

木聚糖酶XYNB的N46D突变、表达及酶学性质变化

对来源于Streptomyces olivaceoviridis的高比活木聚糖酶XYNB进行同源建模和同源序列比较,发现第11族木聚糖酶的催化结构域在β折叠股A3和B3之间存的一个保守的氨基酸位点,该位点与木聚糖酶的pH特性有关.据此设计了XYNB的N46D定点突变.将突变酶XYNBN46D在毕赤酵母中表达,表达的XYNBN46D经纯化后与原酶XYNB(同样经毕赤酵母表达后纯化)进行酶学性质比较,结果表明, XYNBN46D的最适pH值由5.2下降到4.2,pH稳定性也向酸性pH偏移,同时,热稳定性和最适温度也有一定的提高, 但酶的比活性显著下降.结果证实,木聚糖酶XYNB的第46位Asn与其最适pH值相关.对导致酶学性质改变的可能因素进行了分析,结果为进一步的结构与功能研究提供了资料.     

毕赤酵母表达的嗜热蓝状菌β-葡萄糖苷酶N-糖基化修饰的作用与功能

【目的】研究N-糖基化对来源于嗜热蓝状菌β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,Bgl3A)的酶学性质影响。【方法】采用定点突变技术构建了3个去N-糖基化的突变体T44A、S228A、S299A,并分别在毕赤酵母GS115中表达纯化。【结果】与野生型Bgl3A相比,突变体S228A分泌蛋白产量极低,仅能微量检测到p NPG活性;突变体T44A和S299A的最适pH和最适温度没有改变,分别为4.0和75°C,但二者的T_m值和70°C下的热稳定性都明显优于野生型。以p NPG为底物时,突变体S299A和T44A的催化效率分别降低了14.5%和70.0%;以纤维二糖为底物时,T44A的催化效率基本不变,而S299A的催化效率提高了1.1倍。【结论】Bgl3A不同位点的N-糖基化修饰对酶的分泌和酶学性质的影响具有明显差异。其中,N226位的N-糖基化在维持酶的表达和功能方面至关重要,而去除N297位点的N-糖基化可以提高酶的热稳定性及对纤维二糖的催化效率。     

基于酶热稳定性系统计算的乳酸氧化酶热稳定性改造

乳酸氧化酶能够催化乳酸氧化为丙酮酸,具有重要的工业应用价值,但已有研究表明,不同来源的乳酸氧化酶均存在热稳定性不好的问题,影响了其在工业当中的应用。目前对于乳酸氧化酶的研究报道较少,对其热稳定性的改造更未见报道,因此提高乳酸氧化酶的热稳定性具有重要意义。克隆表达了一个高比活乳酸氧化酶(Eg LOD),通过生物信息学辅助分析及表面电荷分析软件(ETSS)对乳酸氧化酶的蛋白结构进行理性分析,基于蛋白表面电荷分布优化设计了9个突变体尝试对其进行热稳定性改良。通过对突变体的筛选获得了两个有效提升热稳定性的突变体D250N,D281N,在60℃下处理30 min仍然能够保持50%以上的酶活,而野生型Eg LOD酶活仅剩20%左右。     

通过N端替换提高木聚糖酶的热稳定性

以来源于Thermomonospora fusca的耐高温木聚糖酶TfxA和来源于Streptomycesolivaceoviridis的高比活木聚糖酶XYNB为亲本,构建出耐热高比活融合木聚糖酶TB,将TB在大肠杆菌BL21和毕赤酵母GS115中进行表达并对表达产物的酶学性质进行分析比较。分析表明,融合蛋白TB最适pH值为6.0,最适温度为70℃,较XYNB有大幅度的提高;在热稳定性方面,TB明显优于XYNB,将两种稀释好的酶液分别在80℃和90℃下热处理3min,TB的热稳定性较XYNB提高了6倍左右;TB的pH稳定性为5～9(相对剩余活性在50%以上的pH范围),较XYNB有所下降,但两者的比活性基本不变,保持了亲本XYNB的高比活性。通过同源建模和序列比较,分析了可能影响融合蛋白TB酶学性质的因素,为进一步研究木聚糖酶的结构与功能提供了新的思路。     

嗜酸真菌Bispora sp.MEY-1酸性糖苷水解酶的产酶优化及在动物饲料中的应用

嗜酸真菌Bisporasp.MEY-1可以分泌多种酸性糖苷水解酶。以不同的农业废弃物和副产品为碳源诱导该菌产酶以提高液体发酵效率并降低生产成本,结果表明0.5%的魔芋粉和9%的麦麸/玉米芯粉/豆粕混合物诱导效果最佳,木聚糖酶、葡聚糖酶、甘露聚糖酶、纤维素酶、淀粉酶、果胶酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶的产量分别为15、50、3.7、5.7、3.2、0.6、3.4、0.1、1.8U·ml-1。菌株MEY-1最适产酶pH为3,温度为30℃。与优良的商业糖苷水解酶生产菌株Trichoderma reesei RUT C30相比,菌株MEY-1分泌的糖苷水解酶偏酸,且在模拟胃肠道条件下保留了更多的木聚糖酶和葡聚糖酶活性,可降低大麦/豆粕饲料的黏度,在动物饲料工业中具有良好的应用前景。     

产肌醇毕赤酵母细胞工厂的优化

【背景】肌醇是一种B族维生素,广泛应用于食品、医药、饲料等领域。微生物发酵法是最具前景的肌醇生产方法,但使用大肠杆菌生产的肌醇在食品及医药领域中的使用受到限制。毕赤酵母作为生物安全菌株是工业上生产异源蛋白的良好宿主,其本身含有天然的肌醇合成途径,具有被改造成为高效生产肌醇细胞工厂的潜力。【目的】通过代谢工程改造毕赤酵母工程菌株,降低副产物的生成并提高肌醇的产量。【方法】以实验室前期构建的产肌醇毕赤酵母工程菌株为出发菌株,确定副产物阿拉伯糖醇、核糖醇和甘露糖合成相关基因。通过关键基因敲除、发酵液中葡萄糖浓度控制降低副产物的产量。通过过表达甘油转运蛋白、甘油激酶和甘油-3-磷酸脱氢酶基因实现产肌醇毕赤酵母对甘油和葡萄糖的共利用,得到重组菌Z10。经过发酵条件优化,进一步提高Z10的肌醇产量。【结果】在最优条件下,重组菌Z10的肌醇产量达到36.7 g/L,是目前酵母类细胞工厂生产肌醇的最高值,副产物总产量与出发菌株相比降低了63.1%。【结论】在毕赤酵母中建立了降低阿拉伯糖醇、核糖醇和甘露糖合成的有效策略,并通过甘油、葡萄糖共利用及相对应的发酵条件优化提高了肌醇产量,为肌醇及其他高价值生物...     

谷氨酸脱羧酶结构及催化机制的研究概述

谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase,GAD)是一种磷酸吡哆醛(pyridoxal-5′-phosphate,PLP)依赖性酶,广泛存在于自然界的动植物和微生物中,在酸性环境下发生结构变化,不可逆地催化L-谷氨酸或谷氨酸盐α-脱羧生成γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)。γ-氨基丁酸在人体中作为一种抑制性神经递质,具有重要的生理功能,可以被广泛应用于食品和制药工业中。本文就谷氨酸脱羧酶结构及催化机制的研究进展进行概述。     

发酵法生产谷氨酰胺转胺酶(MTG)的中试研究

比较了摇瓶和 2 .5L种子罐所培养的种子液 ,并在 5L罐上考察了以种子罐培养种子时不同接种量对发酵过程的影响。在将 5L小罐实验结果放大到 30 0L和 3m3 罐的中试规模时 ,分别采用以vvm相等和KLa相等的原则 ,对通风量进行放大 ,以P V相等为依据对搅拌转速进行放大。结果表明 ,当采用种子罐培养种子液时 ,适宜的种龄为 18～ 2 0h ,接种量为 2 % ,30 0L罐中酶活和生产强度分别达到 3.12u mL和 78.0u L·h ,均高于 5L罐的水平 ,3m3 罐酶活为 2 .70u mL ,接近于 5L罐的酶活水平 ,表明本研究所采用的通气量、搅拌转速等放大原则是合理的     

增加植酸酶基因appA-m的拷贝提高其在巴斯德毕赤酵母的表达量

为了进一步提高植酸酶的发酵效价,降低植酸酶生产成本,对毕赤酵母表达载体pGAPZα-A进行了改造。将表达载体pPIC9的AOX1启动子序列引入pGAPZα-A,使之成为甲醇可诱导型表达载体pAOXZα,插入植酸酶基因appA-m后得到重组载体pAOXZα-appA-m。以染色体上带有一个拷贝的appA-m基因、发酵效价可达到7.5×106IU/mL发酵液的重组酵母菌株74#为受体菌进行转化,在该重组菌株的染色体上的另一位点整合含有植酸酶基因的表达盒,经筛选到高表达植酸酶的重组子。通过PCR进行验证,植酸酶基因被整合到重组酵母的染色体上,且受体菌中原有的植酸酶基因结构未改变。重组菌在5L发酵罐经甲醇诱导120h植酸酶蛋白表达量达到4mg/mL发酵液,酶活性(发酵效价)达到1.2×107IU/mL发酵液以上,较含单拷贝植酸酶基因的受体菌株表达量有较大程度提高。PCR检测及表达量分析证明改良的菌株具有很好的遗传稳定性和表达稳定性。