从免疫及天然噬菌体抗体库中筛选抗rP27Kip1单链抗体的研究

用重组p27Kip1蛋白(rP27Kip1) 免疫小鼠,从免疫和未经免疫的小鼠脾脏抽提mRNA并扩增小鼠H链(H链)及L链(L链)基因,分别组装成单链可变区片段(ScFv)基因,构建噬菌体免疫抗体库及天然抗体库. 文库仅经一轮抗原-抗体亲和筛选后,用TaqⅠ/HinfⅠ酶切分析转化子. 获自免疫抗体库的64个克隆中,有11个克隆的酶切片段相同,而天然抗体库的64个克隆的片段则都彼此不同,但有1个克隆的酶切片段与免疫抗体库的11个克隆酶切片段相同. 将这些酶切图谱相同的重组片段分别克隆入原核表达载体pET28b(+),并在大肠杆菌(E. coli)中表达,表达产物经ELISA分析,证实可特异结合rP27Kip1抗原,一方面说明在抗体筛选过程中辅以酶切图谱分析,可以有效提高筛选效率,另一方面,也说明从噬菌体抗体库筛选特异性抗体是制备单克隆抗体(McAb)的理想途径之一.     

人Notch1受体shRNA重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的:构建人特异性受体Notch1短发夹RNA重组腺病毒载体,探讨其对人脐带间充质干细胞中Notch1表达的影响,以便进一步研究Notch1的生物学功能.方法:设计合成Notch1序列干扰序列,插入到pGenesil-1.1上构建重组质粒,取阳性克隆进行酶切及DNA测序鉴定.通过同源重组,构建含目的基因的重组腺病毒质粒栽体pGsadeno-Notch1-shRNA.经PacI线性化后脂质体介导转染到HEK 293细胞,包装后得到腺病毒颗粒.产生的重组腺病毒体外转染人脐带间充质千细胞,RT-PCR和Western blot 检测特异性shRNA对人脐带间充质干细胞中Notch1蛋白在mRNA及蛋白表达水平的抑制效果.结果:经酶切及DNA测序重组腺病毒质粒构建正确.重组腺病毒转染人脐带间充质干细胞3d后,RT-PCR及Western blot检测,可显著下调细胞内Notch1的转录及蛋白表达水平.对Notch1 mRNA和蛋白表达的抑制率分别为70.31％和86.97％,具有统计学意义(P＜0.05).结论:成功构建了表达人Notch1受体shRNA的重组腺病毒载体,为研究Notch1在肿瘤学中的生物学作用及机制奠定基础.     

全人源抗结肠癌噬菌体单链抗体库的构建及筛选鉴定

采用体外致敏法和EBV转化技术联合噬菌体展示技术构建噬菌体呈现型单链抗体库.从中筛选获得阳性克隆,并进行ELISA、免疫组化及测序鉴定.结果得到了库容为4.0×109的初级噬菌体抗体库,全长ScFv(Single-chain Fv)基因的插入率为90%.筛选获得两个克隆对HT-29呈强阳性反应,而与HFF等人正常细胞系呈弱阳性或阴性反应.免疫组织化学鉴定表明克隆F12与结肠癌组织和结肠癌旁组织阳性率的差别有统计学意义.由上述结果可见构建库容量达4.0×109的全人源抗结肠癌噬菌体单链抗体库是完全可行的,经筛选及鉴定获得了特异性较强的噬菌体克隆,为结肠癌的临床导向诊断和治疗奠定了基础.     

人源天然抗TNF-α ScFv抗体的筛选及性质分析

目的以人肿瘤坏死因子(human tumour necrosis factor-α,human TNF-α)为靶抗原,从构建好的人源天然单链抗体(single-chain antibody fragment,ScFv)噬菌体抗体库中筛选对应的ScFv抗体,验证其中和活性后测定动力学常数(kinetic dissociation,KD)。方法以TNF-α梯度稀释后包被免疫管,对人源天然ScFv噬菌体抗体库进行3轮吸附-洗脱-扩增的富集筛选,制备TNF-α单克隆噬菌体抗体颗粒,经ELISA试验筛选阳性克隆后测序并分析;将正确的阳性抗体序列亚克隆到pET-26b表达载体上,原核表达后用Ni Sepharose 6 Fast Flow介质进行纯化;用MTT比色法对筛选的ScFv进行中和活性验证,并测定其中和抗体的KD。结果通过3轮筛选共得到18个正确的抗体氨基酸序列,对其原核表达及纯化后得到的6株可溶性表达的抗TNF-αScFv进行中和活性验证,并对其中有中和活性的4株ScFv抗体测定KD。结论从人源天然ScFv噬菌体抗体库中成功地筛选出4株抗人TNF-α的ScFv中和抗体,其中1株ScFv抗体的KD为4.80×10~(-8),细胞毒中和率达到48.9%,达到了药用级抗人TNF-α中和抗体的研发要求,为全分子抗体药物的构建及稳定细胞株的筛选奠定了一定的基础。     

鼠源抗B型肉毒毒素Fab抗体库的构建及初步筛选

目的:应用重组噬菌体抗体库技术制备抗B型肉毒毒素Fab抗体。方法:用重组B型肉毒毒素重链C端片段(BoNTB/Hc)免疫BALB/c小鼠,从其脾淋巴细胞扩增免疫球蛋白Fd段和κ链基因,克隆至表达载体pComb3中,并将抗体Fab段表达于噬菌体表面,建立容量为5.96×106cfu的噬菌体抗体库。以BoNTB/Hc为抗原对所建抗体库进行4轮亲和筛选,获得与B型肉毒毒素特异性结合的克隆,并进行序列测定。结果:构建了抗B型肉毒毒素Fab抗体库,筛选出特异性克隆1个。结论:从鼠源噬菌体免疫抗体库中初步获得了特异性抗B型肉毒毒素的Fab抗体。     

丙型肝炎病毒包膜蛋白E2可溶性单链可变区抗体在大肠杆菌中的表达

利用分子生物学技术,构建表达丙型肝炎病毒（HCV）包膜蛋白E2的人源单链可变区抗体（ScFv)的原核表达载体,并在大肠杆菌JM109中表达可溶性的HCV－E2－ScFv。以重组的HCV E2蛋白为包被抗原,利用噬菌体抗体库的表面展示技术,筛选含有HCV－E2－ScFv基因的噬菌体克隆,从噬菌体抗体阳性克隆中提取质粒,经Ncol/NotⅠ酶切鉴定后,该ScFv基因由750bp组成,将菜亚克隆到pCANTAB5E载体中,转化大肠杆菌JM109,在其培养上清中获得了可溶性HCV E2单链可变区抗体的表达。酶联免疫吸附法（ELISA）证实表达的HCV－E2－ScFv进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）,证实表达的HCV－E2－ScFv的分子量为28KD,为应用HCV－E2－ScFv进行肝组织免疫组织化学和细胞内免疫基因治疗研究奠定了基础。     

从构建的噬菌体抗体库中筛选抗甲肝人单抗

用固相化甲肝抗原,对所构建的噬菌体抗体库进行了3轮淘筛。第3轮淘筛后洗脱下来的噬菌体,较第l轮增加了近100倍。含有抗体重链基因和轻链基因的重组克隆．也由淘筛前的25％增至100％。说明甲肝抗原对抗体库的淘筛,富集了表面呈现甲肝人单抗的噬菌体。经夹心ELISA法筛选到抗甲肝病毒噬菌体抗体,并以竞争抑制实验进一步证实了这些抗体的特异性。     

鼠源性抗雄性特异性抗原噬菌体Fab抗体的制备及分析

利用噬菌体抗体库筛选技术获得抗雄性特异性抗原的噬菌体Fab抗体,首次采用雄鼠脾细胞对鼠源性抗雄性特异性抗原噬菌体Fab抗体库进行3轮亲和富集和2轮雌鼠脾细胞吸附,对筛选后特异性噬菌体Fab抗体进行ELISA分析,重组率鉴定及基因测序分析。结果显示,5次筛选后的15个菌落中有9个能产生抗雄性特异性抗原特异性噬菌体抗体,噬菌体Fab抗体的基因重组率为60%,E5克隆的重链、轻链可变区序列分别属于VH1和VκⅣ基因家族,这为挑选出高亲和力的抗雄性特异性抗原噬菌体Fab抗体奠定了实验基础,将推进雄性特异性抗原及其抗体的研究进程,并为性别控制研究开创新途径。     

噬菌体呈现技术制备结肠癌抗独特型抗体

 以纯化的鼠抗人结肠癌细胞单克隆抗体 (简称单抗 )MC5与钥孔血蓝素 (KLH)的交联物经腹腔免疫Balb c小鼠 ,取脾分离mRNA .RT PCR分别扩增抗体重、轻链可变区基因片段 (VH 和VLcD NA ,大小分别约为 340bp和 32 0bp) ,二者经linkerDNA连接形成ScFv(singlechainvariablefragment)DNA(约 75 0bp) .将ScFvDNA与噬菌粒载体pCANTAB5E的连接产物转化于大肠杆菌TG1,经辅助噬菌体M13KO7感染后 ,获得重组噬菌体抗体ScFv文库 .以单抗MC5对ScFv文库进行 4轮亲和筛选后 ,随机挑取 80个克隆经酶联免疫吸附实验 (ELISA)筛选出 2 2个呈现ScFv形式抗独特型抗体(抗 IdScFv)的噬菌体单克隆 .竞争抑制实验表明 ,在 2 2个阳性克隆中有 4个克隆所呈现的抗 IdScFv属β或γ型 .针对单抗MC5的噬菌体呈现型抗 IdScFv的制备 ,为筛选新的结肠癌重组抗 Id瘤苗候选分子奠定了基础     

人源天然ScFv噬菌体抗体库的构建及鉴定

噬菌体抗体库技术是获得治疗性抗体的一条重要途径。以20份健康人外周血为样本,通过提取淋巴细胞、逆转录－PCR（RT PCR）、抗体可变区基因的扩增、重叠PCR获得单链抗体（ScFv）基因,将ScFv克隆入噬粒载体,通过近300次的电转化获得了库容量为1.3×109的全人源天然ScFv噬菌体抗体库。通过随机挑克隆测序和用5种不同抗原筛选对抗体库进行了初步验证。随机测序表明抗体库具有较好的多样性,用5种不同抗原对其进行筛选,均获得了特异性噬菌体抗体的不同富集,表明成功构建了一个多样性良好的人源天然ScFv噬菌体抗体库。     

抗人AFP抗体噬菌体呈现文库的构建筛选及基因序列测定

从人ＡＦＰ免疫小鼠脾细胞ｍＲＮＡ中扩增出全套抗体Ｖ区基因并随机拼接为ＳｃＦｖ基因,构建全套ＳｃＦｖ基因噬菌体呈现文库,经两轮ｐａｎｎｉｎｇ筛选富集,一次从９４个单个重组噬菌体克隆中筛选到１４个具有ＡＦＰ结合活性的克隆,测定两个阳性克隆中ＳｃＦｖ基因的核苷酸序列,获得一个Ｖ＿Ｈ基因和两个Ｖ＿Ｋ基因,其基因序列分别与鼠ＩｇＶ＿ＨＪ５５８、Ｖ＿ｋ－ＯＸ１和Ｖ＿ｋ４／５家族同源性最高;推导出的氨基酸序列中均含有抗体Ｖ区特征性的两个恒定的半胱氨酸残基、具有明确的三个ＣＤＲ和四个ＦＲ序列,表明这三个基因均系新发现的功能性鼠抗体Ｖ区基因序列。     

Production and characterization of the single chain antibodies against human alpha2b-interferon

A combinatorial library of single-chain antibodies (ScFv) from mice immunized with human alpha2b interferon (hIFN-alpha2b) was constructed. For obtaining of phage display antibodies the DNA fragments of ScFv were cloned into phagemid vector pCANTAB-5E and rescued from Escherichia coli cells by infection with bacteriophage M13. Bacterial clones synthesizing specific ScFv against hIFN-alpha2b were isolated by several rounds of affinity selection of phage library. After isolation and affinity purification of ScFv-IFN from bacteria cells a high ability to binding of the hIFN-alpha2b has been shown. The sequencing of isolated ScFv DNA and analysis of the data obtained have been carried out. The data of expression stability of obtained E. coli producers such as some features of ScFv expression are also discussed.     

天然兔源噬菌体单链抗体库的构建与鉴定

目的:构建天然兔源噬菌体单链抗体库。方法:采用RT-PCR法从未免疫的兔子脾脏中克隆得到抗体重链可变区(VH)与轻链可变区(VL)基因,重叠PCR将VH和VL拼接成scFv片段,将scFv连接到噬菌粒pComb3XSS上,电转入XL1-Blue菌中,得到单链抗体库,并用此抗体库筛选抗肌酸激酶抗体。结果:构建了容量为4×108,基因重组率95%的单链抗体库,DNA指纹图谱显示抗体库多样性良好。以肌酸激酶为抗原,从该库中筛到3株抗肌酸激酶的抗体。结论:分析表明构建的天然兔源单链抗体库质量良好,可用于快速筛选、制备多种单链抗体。     

抗TNF-α单链抗体噬菌体展示文库的建立和鉴定

应用噬菌体展示技术构建抗肿瘤坏死因子α(tumornecrosis factor α,TNF-α)单链抗体(single chain Fv,scFv)文库,从中筛选抗TNF-αscFv并进行鉴定.利用重组人TNF-α(rhTNF-α)免疫小鼠,分别扩增小鼠VH和VL基因,经重叠延伸反应将VH和VL基因拼接成scFv基因,以SfiⅠ/NotⅠ位点定向插入pCANTAB 5E噬菌粒载体,转化E.coli TG1,构建了库容为4.6×108的抗TNF-α单链抗体库.对抗体库进行3轮富集筛选后,ELISA检测阳性克隆的抗原特异性,取1株阳性克隆进行测序分析.结果表明,抗TNF-αscFv基因序列长774bp,编码258个氨基酸.将此阳性克隆转化E.coliHB2151,IPTG诱导可溶性scFv的表达,经SDS-PAGE和Western印迹分析,scFv的分子量约为28kD.经亲和纯化后的scFv可与rhTNF-α结合,并可中和由rhTNF-α引起的L929细胞毒性.本文利用噬菌体抗体库筛选到了高亲和力的抗TNF-αscFv,为研制临床免疫治疗的新型抗体奠定了实验基础.     

噬菌体抗体库的构建及抗乳腺癌细胞单链抗体的筛选

构建抗人乳腺癌细胞MCF 7的噬菌体单链抗体库 ,从中筛选MCF 7细胞特异性单链抗体。用MCF-7细胞免疫BALB C小鼠 ,取脾脏 ,提取总RNA ,用RT-PCR技术扩增小鼠抗体重链 (V_H)和轻链 (V_L)可变区基因 ,经重叠PCR(SOE-PCR) ,在体外将V_H和V_{L连接成单链抗体 (scFv)基因 ,并克隆到噬菌粒载体pCANTAB5E中 ,电转化至大肠杆菌TG1,经辅助噬菌体超感染 ,构建噬菌体单链抗体库。从该抗体库中筛选特异性识别MCF-7细胞的噬菌体单链抗体 ,将表面展示单链抗体的单克隆噬菌体转化大肠杆菌TOP10进行可溶性表达。成功地构建了库容为12×10⁶ 的抗MCF-7乳腺癌细胞的单链抗体库 ,初步筛选到了与MCF 7细胞特异性结合的scFv,Westernblot检测表明 ,在大肠杆菌TOP10中实现了单链抗体可溶性表达}     

Construction of a single-chain variable-fragment antibody against the superantigen Staphylococcal enterotoxin B

Staphylococcal food poisoning (SFP) is one of the most prevalent causes of food-borne illness throughout the world. SFP is caused by 21 different types of staphylococcal enterotoxins produced by Staphylococcus aureus. Among these, staphylococcal enterotoxin B (SEB) is the most potent toxin and is a listed biological warfare (BW) agent. Therefore, development of immunological reagents for detection of SEB is of the utmost importance. High-affinity and specific monoclonal antibodies are being used for detection of SEB, but hybridoma clones tend to lose their antibody-secreting ability over time. This problem can be overcome by the use of recombinant antibodies produced in a bacterial system. In the present investigation, genes from a hybridoma clone encoding monoclonal antibody against SEB were immortalized using antibody phage display technology. A murine phage display library containing single-chain variable-fragment (ScFv) antibody genes was constructed in a pCANTAB 5E phagemid vector. Phage particles displaying ScFv were rescued by reinfection of helper phage followed by four rounds of biopanning for selection of SEB binding ScFv antibody fragments by using phage enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Soluble SEB-ScFv antibodies were characterized from one of the clones showing high affinity for SEB. The anti-SEB ScFv antibody was highly specific, and its affinity constant was 3.16 nM as determined by surface plasmon resonance (SPR). These results demonstrate that the recombinant antibody constructed by immortalizing the antibody genes from a hybridoma clone is useful for immunodetection of SEB.     

Construction of a human scFv antibody library with VH regions randomized and its application

A non-immunized human single chain variable fragment (scFv) library containing 2.5 × 10(7) individual clones was constructed from antibody variable region genes of 200 non-immunized donors. ScFv gene repertories were generated by randomly combining rearranged variable regions of heavy chain (VH) and natural occurring light chain (VL) using overlapping extension PCR (OE-PCR). Five recombinant protein antigens from different species were successfully used to select specific binders. Phage ELISA showed that the recombinant phage particle could specifically bind to non-structural protein 1 of Avian influenza virus. This method can therefore efficiently generate a phage antibody library.