全人源化抗结肠癌单链抗体基因的克隆和表达

分离大肠癌患者外周血单个核细胞 (PBMC) ,在体外用灭活的大肠癌细胞再次致敏后 ,经EBV转化 ,然后用有限稀释法克隆分泌抗大肠癌细胞抗体的B细胞 ;多次PCR扩增和克隆其抗体可变区基因 (V_H/V_LcDNA) ,并用编码 (Gly₄Ser)₃ 的互补序列连接成ScFvcDNA(V_H linker V_L) ,经酶切克隆入载体fUSE 5RF ,使之呈现于噬菌体表面。通过用 3轮肿瘤细胞和正常人PBMC淘选后 ,ELISA检测 80%的单克隆噬菌体抗体显示了很强的阳性反应。以上结果初步说明 :联合应用体外致敏、EBV转化、PCR扩增和噬菌体呈现技术制备高亲和力全人源化的抗肿瘤抗体是可行的.     

GOLPH2的原核表达、纯化、抗体制备和初步应用

目前发现GOLPH2蛋白与肝癌密切相关,将golph2基因进行克隆、表达并制备多克隆抗体,为进一步研究其功能奠定基础.应用RT-PCR技术,从人肝癌细胞系HepG2细胞中扩增得到golph2 cDNA,将其克隆到原核表达载体pET21a(+)-TRX内、转化大肠杆菌DH5a,用IPTG诱导其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达.His-tag磁珠纯化试剂盒纯化重组蛋白GOLPH2,SDS-PAGE鉴定.将纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,采用ELISA、Western blot方法检测抗体的灵敏度和特异性,并测定临床血清标本中GOLPH2蛋白水平.成功地构建了表达TRX-GOLPH2融合蛋白的原核表达质粒pET21a(+)-TRX-GOLPH2.并在大肠杆菌BL21(DE3)内得以高效表达,且以可溶性的形式存在.SDS-PAGE和Western blot证实,重组GOLPH2蛋白质与预期结果一致.抗血清能够特异地识别52 kD重组蛋白、73 kD细胞裂解液和血清蛋白质.成功制备了GOLPH2蛋白质和多克隆抗体,能用于后续研究.     

HOXA7促进宫颈癌细胞体外增殖的实验研究

该研究敲低同源盒基因A7(homeobox genes A7,HOXA7)后,研究宫颈癌细胞Siha、Caski体外增殖的影响。将HOXA7基因的si-RNA稳定转染至Siha、Caski细胞;RNA干扰的效果采用RTPCR、Western blot进行鉴定;细胞生长速度采用MTT法、细胞倍增时间实验来进行检测;平板克隆形成实验检测细胞接种的存活率;流式细胞术检测细胞周期。RNA干扰结果显示,敲低HOXA7基因后,Siha、Caski细胞中HOXA7表达下调。MTT结果显示,实验组Siha/si-HOXA7、Caski/si-HOXA7细胞生长速度明显下降。研究发现,对照组细胞Siha/NC、Caski/NC与实验组细胞Siha/si-HOXA7、Caski/si-HOXA7的平均倍增时间为分别为5.652±0.352 h、4.650±0.340 h、7.342±0.331 h和6.987±0.330 h;对照组细胞Siha/NC、Caski/NC与实验组细胞Siha/si-HOXA7、Caski/si-HOXA7的克隆形成率分别为35.400%±1.429%、31.700%±1.943%、24.200%±1.098%和21.200%±1.838%。分别与对照组细胞Siha/NC、Caski/NC比较,实验组细胞Siha/si-HOXA7、Caski/si-HOXA7增殖、倍增时间和克隆形成能力差异极显著(P0.01)。实验组细胞周期也发生改变:G_1期细胞增多、S期细胞减少。这说明,HOXA7基因可以促进宫颈癌细胞Caski、Siha的增殖,这为进一步探索HOXA7基因的功能及研究宫颈癌的发病机制打下了坚实的基础。     

抗大肠癌噬菌体单链抗体的筛选及初步鉴定

 应用 3种方法 (肿瘤细胞膜表面和胞内、裸鼠体内和组织切片 ) ,从全人源化的抗大肠癌噬菌体初级抗体库中筛选肿瘤特异性的噬菌体单链抗体 (Sc Fv) .在肿瘤细胞经过 3轮亲和选择 ,回收结合胞膜和内化进入胞内的噬菌体 ,得到抗肿瘤噬菌体单链抗体的富集倍数为 430倍 ;荷瘤裸鼠体内注入初级抗体库后 ,在不同时刻点处死裸鼠 ,回收肿瘤组织内的噬菌体 ,其回收率在 2 4 h时最高 ;初级抗体库与大肠癌组织切片亲和选择后 ,从冰冻组织切片上比从石蜡组织切片上回收得到的噬菌体高出约 1 .6倍 .从上述方法挑选单克隆 ,经 ELISA筛选抗大肠癌阳性噬菌体克隆株 ,分离得到 5个对大肠癌细胞反应较好的单克隆噬菌体单链抗体 .进一步用细胞 ELISA检测对各种肿瘤细胞的特异性反应 ,其中 4个对大肠癌细胞有很好的特异性 ,1个克隆对所有肿瘤细胞均有反应 .因此 ,3种方法用于筛选抗大肠癌噬菌体初级抗体库是有效的 ,具有推广和应用价值 .     

全人源抗结肠癌噬菌体单链抗体库的构建及筛选鉴定

采用体外致敏法和EBV转化技术联合噬菌体展示技术构建噬菌体呈现型单链抗体库.从中筛选获得阳性克隆,并进行ELISA、免疫组化及测序鉴定.结果得到了库容为4.0×109的初级噬菌体抗体库,全长ScFv(Single-chain Fv)基因的插入率为90%.筛选获得两个克隆对HT-29呈强阳性反应,而与HFF等人正常细胞系呈弱阳性或阴性反应.免疫组织化学鉴定表明克隆F12与结肠癌组织和结肠癌旁组织阳性率的差别有统计学意义.由上述结果可见构建库容量达4.0×109的全人源抗结肠癌噬菌体单链抗体库是完全可行的,经筛选及鉴定获得了特异性较强的噬菌体克隆,为结肠癌的临床导向诊断和治疗奠定了基础.     

全人源抗肝癌噬菌体单链抗体库的构建与筛选鉴定

体外致敏并用EBV转化肝癌患者的PBMC．用PCR分别扩增VH和VL基因并组成ScFv基因．将ScFv基因与载体fuse5连接后，电击转化大肠杆菌MC1061，构建噬菌体呈现型ScFv库．用人肝癌细胞及人肝细胞对初级噬菌体抗体库进行亲和富集及phage-ELISA筛选．筛选获得的阳性克隆进行ELISA及免疫组化鉴定并测序．结果表明，经EBV转化的4例肝癌患者PBMC，ELISA检测均有抗肝癌抗体产生，经多次PCR，扩增出6种VH（γ、μ）和9种VL（κ、λ）基因，经连接组成54种ScFv基因．将ScFv基因与载体连接后，导入大肠杆菌MC1061，得到库容为1．0×10^8的初级噬菌体抗体库，全长ScFv基因的插入率为80％．用人肝癌细胞系HepG2和人肝细胞系QSG-7701对抗体库进行三轮正负淘选和富集后，从中随机挑取533个克隆进行ELISA筛选，得到179个阳性克隆，阳性率为33．6％．将179个阳性克隆进一步进行其他细胞系的鉴定，发现克隆A82对肝癌细胞系HepG2、人胚肾上皮细胞系HEK293呈强阳性反应，免疫组织化学结果显示与人肝细胞癌组织有特异性反应，而不与正常肝组织反应．且A82的相对亲和力为2．4mol／L，解离常数Kd为5．32×10^-9mol／L，显示其亲和力较高．对克隆A82进行测序分析，结果表明：A82全长742bp，含linker cDNA序列45bp，重链可变区基因与人胚系IgVH3-23有94.3％的同源性，轻链可变区基因与人胚系IgV4-2有94．9％的同源性，V．D．J分别属于VH3-23-D2-21-JH6-linker-V4-2-JL2．由上述结果可见，应用体外抗原致敏方法和EBV转化技术联合噬菌体抗体库技术，构建了库容量达1×10^8的全人源抗肝癌单链抗体库，通过细胞ELISA和免疫细胞化学鉴定，获得的噬菌体抗体克隆A82具有较强的特异性，为肝癌的临床诊断及导向治疗奠定了基础．