鲤sPLA2-III基因结构、系统发育和表达特征

磷脂酶A₂在磷脂代谢、炎症反应、细胞增殖和动脉粥样硬化等生理病理过程中发挥作用。为了探究sPLA₂-III在鲤(Cyprinus carpio Linnaeus)中的生物学功能, 实验使用BLAST同源搜索和线性分析在鲤 (Cyprinus carpio)基因组中挖掘得到5个sPLA₂-III基因, 分别位于5个连锁群, 分别命名为Ccpla2g3a1、Ccpla2g3a2、Ccpla2g3b、Ccpla2g3c1和Ccpla2g3c2。基因结构和序列分析显示Ccpla2g3as含有7个外显子, Ccpla2g3b和Ccpla2g3cs则均含有4个外显子, 分别编码530、525、461、752和753个氨基酸, 均含有PLA₂_bee_venom_like region和sPLA₂-III特征序列。线性分析显示, Ccpla2g3a1和Ccpla2g3a2, Ccpla2g3c1和Ccpla2g3c2来自鲤特异的染色体加倍事件。从2R (Two rounds of genome duplication)鱼雀鳝 (Lepisosteus oculatus)到3R(Fish-specific genome duplication, FSGD)鱼斑马鱼(Danio rerio)等, 雀鳝的pla2g3a(b)加倍为3R鱼的pla2g3a和pla2g3b, pla2g3c因在3R鱼的一个连锁群上丢失, 故3R鱼中只保留一个基因。同源性分析表明已有鱼类Pla2g3a、Pla2g3b和Pla2g3c垂直同源蛋白之间相似性分别为48.8%—93.2%、37.6%—74.3%和49.6%—97.6%, 鲤和斑马鱼的垂直同源基因之间相似性最高。系统发育结果显示, 鱼类及其祖先雀鳝的Pla2g3c以100%的置信值归在一支, 雀鳝Pla2g3a(b)与除了鲤科鱼类 (鲤和斑马鱼) Pla2g3b外的Pla2g3a和Pla2g3b以96%置信值在一支, 鲤和斑马鱼Pla2g3b单独形成一支表明在进化过程中该基因变异较大。荧光定量PCR结果表明Ccpla2g3as在整个鲤早期发育阶段表达量均较低, 在成鱼肝脏中表达量最高 (P<0.01); Ccpla2g3b在鲤受精后0.5h的表达量显著高于之后各取样点 (P<0.05), 在成鱼卵巢中表达量最高 (P<0.01); Ccpla2g3cs在120h表达量达到最高, 在成鱼脑中表达量最高 (P<0.01)。实验比较全面地揭示了鲤sPLA₂-III亚家族基因结构、系统发育和表达特征。     

建鲤肠型脂肪酸结合蛋白基因的分离及其SNPs与增重的相关分析

文章采用PCR方法从建鲤 (Cyprinus carpio var. jian) 基因组分离到2个肠型脂肪酸结合蛋白基因 (Fatty acid binding protein 2, FABP2), ORF长度均为399 bp, 相似度为92.2%, 分别记为jlFABP2a、jlFABP2b, 和斑马鱼 (Danio rerio) FABP2 ORF的相似度分别为88.0%和90.5%。jlFABP2s基因结构与FABPs家族其他成员一致, 由4个外显子和3个内含子组成, 2a和2b间内含子序列和长度差异明显。系统树显示这2个基因对应斑马鱼的1个FABP2基因, 和鲤鱼染色体数是斑马鱼的2倍一致。实时荧光定量PCR结果显示, jlFABP2a、2b在建鲤肠中的表达量极显著高于脑、肝脏、肌肉、肾脏、心脏、性腺等其他组织 (P<0.01), 且2a表达量显著 (雄鱼, P<0.05) 或极显著 (雌鱼, P<0.01) 高于2b, 但在其他组织则2b表达量稍高, 暗示2a为肠特异性表达, 2b则为广谱表达。通过比对8尾建鲤的2a和2b基因序列, 在2a和2b上分别找到12个和4个SNP, 均位于内含子上。使用PCR-RFLP 法检测jlFABP2a 上4个SNP 位点I1-A15G、I1-A99G、I2-C487T和I3-A27T在建鲤选育群体中的基因型分布, 并进行了基因型与个体增重的关联分析, 结果表明, 4个位点与雌、雄成鱼阶段增重分别有极显著或显著相关。同时考虑4个位点的基因型与增重的关系, 结果基因型AGGGCCXX 和AGGGXXAT的个体平均增重比其他个体快15%, 这两种基因型个体在选育群中占了9%, 具有较大的选育空间, 可用于建鲤分子育种计划中。     

青海湖裸鲤CYP17a2基因的克隆及表达分析

CYP17a2基因是细胞色素CYP17(cytochrome P450,CYP)超家族成员之一,在卵巢发育过程中,可以与CYP17a1共同作用控制卵子的发育和成熟。研究和掌握青海湖裸鲤(Gymnocypris przewalskii)卵巢发育的基本规律,可为该鱼种的人工增殖放流及其资源保护和恢复提供技术支撑。本研究采用普通PCR和RACE方法克隆得到了青海湖裸鲤CYP17a2基因全长c DNA序列,并分析了其生物信息学意义,通过实时荧光定量PCR确定了CYP17a2基因在青海湖雌性裸鲤各组织中的表达分布特征。该基因的c DNA序列全长为1 871 bp,共编码390个氨基酸,所编码的氨基酸序列与斑马鱼和鲤鱼的同源性最高,分别为69%和64%。该基因在卵巢、卵巢膜、脑、肌肉、肝胰脏中均有表达,以在卵巢中表达量最高(p0.01)。本研究结果将为进一步开展CYP17a2基因在青海湖裸鲤卵巢发育的分子调节机理的研究中提供基础数据。     

斑马鱼nr1d4a和nr1d4b基因的表达及其对不同环境刺激的响应简

研究获得了斑马鱼nr1d4a和nr1d4b基因的cDNA,进行了序列比对和系统进化分析,并采用实时定量RT-PCR(qPCR)方法研究了其表达模式及对不同环境刺激的转录反应。研究发现,斑马鱼nr1d4a和nr1d4b是由基因复制产生的旁系同源基因,具有高度保守的DNA结合结构域和配体结合结构域。斑马鱼nr1d4a和nr1d4b的表达模式具有明显的差别。nr1d4a在胚胎发育早期的表达量很低,72 hpf时开始显著升高;而nr1d4b具有较高水平的母源性表达,6 hpf时的表达量明显降低,但也在72 hpf显著回升。nr1d4a在脑和肾脏中表达量最高,其次是鳃、卵巢、精巢和眼,在肝脏中的表达量最低;nr1d4b在卵巢中表达量最高,其次是精巢和脑,在肠道和心脏中表达量最低。斑马鱼nr1d4a和nr1d4b都能被多种环境刺激瞬时诱导表达。16℃低温处理0.5h就能显著诱导斑马鱼nr1d4a和nr1d4b基因的表达,但处理6h后其诱导效应开始下降并逐渐消失。除低温外,重金属(2μmol/L镉)、缺氧(5%氧气)和盐度(5‰)处理均能瞬时诱导nr1d4a和nr1d4b的表达,说明nr1d4a和nr1d4b基因可能参与斑马鱼对多种环境刺激的适应性反应。研究为深入揭示鱼类nr1d4a和nr1d4b基因的生物学功能及其表达调控机制奠定了基础。     

斑马鱼M3受体基因克隆、序列分析及表达分布

目的:为了了解斑马鱼乙酰胆碱蕈毒碱受体3(ZM3a和ZM3b)的基因序列以及在不同组织的表达情况。方法:首先利用RT-PCR方法分离克隆斑马鱼M受体ZM3a和ZM3b基因并用生物软件对其进行生物信息分析;再用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测ZM3a和ZM3b基因在组织中的相对表达量。结果:成功获得ZM3a基因cDNA长为2 161bp,编码595个氨基酸。ZM3b基因长为1 729bp,编码494个氨基酸。ZM3a与其他脊椎动物氨基酸相似性在54.7%~64.56%之间,ZM3b与其他脊椎动物相似性在48.01%~51.95%之间。ZM3a和ZM3b基因在脑,尾部神经系统和脊髓等神经系统中表达较高,在其他外周组织中均能检测到表达但表达水平相对较低。结论:不同物种间的M3的氨基酸序列具有较高的保守性。ZM3a和ZM3b在斑马鱼各组织中均有表达,说明ZM3a和ZM3b基因可能参与多种生理功能的调节。     

黄河裸裂尻鱼肌酸激酶M-CK cDNA的克隆及组织表达分析

肌酸激酶(CK)能够催化磷酸基在二磷酸腺苷(ADP)和磷酸肌酸之间的可逆性转移,在细胞能量代谢过程中发挥重要作用。本研究利用RT-PCR和RACE方法克隆了黄河裸裂尻鱼(Schizopygopsis pylzovi)肌酸激酶基因全长c DNA序列,并进行了生物信息学分析和系统发育关系研究。黄河裸裂尻鱼肌酸激酶c DNA全长1 599 bp,开放阅读框(ORF)1 143 bp,编码380个氨基酸,具有典型的N-端结构域和C-端催化结构域。氨基酸序列同源性分析表明,黄河裸裂尻鱼肌酸激酶与斑马鱼(Danio rerio)和鲤(Cyprinus carpio)M3-CK有较高的同源性,其序列一致度达94%以上。系统发育分析显示,黄河裸裂尻鱼肌酸激酶与斑马鱼和鲤的M3-CK聚在一支,形成一个单系群,初步判定克隆获得的黄河裸裂尻鱼肌酸激酶基因可能与鲤和斑马鱼M3-CK是直系同源基因。利用Real-time PCR方法检测和分析了黄河裸裂尻鱼主要组织肌酸激酶m RNA表达水平,肌肉、肠、眼、心中肌酸激酶转录本表达较高,在肝胰脏和脑中表达微弱。肌酸激酶在肌肉、肠、和心中高表达与其能量代谢功能相适应,而在眼组织中的高表达是否与肌酸激酶的其他功能相关,有待于进一步研究。     

黄体酮对成年斑马鱼下丘脑-垂体-性腺轴相关基因转录表达的干扰效应

黄体酮(P4)是一种类固醇激素。为了探究P4的内分泌干扰效应, 选择成年斑马鱼(Danio rerio)作为受试生物, 研究了P4对斑马鱼下丘脑-垂体-性腺轴(HPG轴)相关基因转录表达影响。成年斑马鱼在不同浓度P4(2、11和16 ng•L–1)下处理21 d。结果显示: 暴露于高浓度组的P4能够抑制雌鱼大脑中促性腺激素释放激素2(gnrh2)、促性腺激素释放激素3(gnrh3), 卵泡刺激素(fshb)、雌激素受体1(esr1)基因的转录表达; 然而诱导了雄鱼大脑中fshb、黄体生成素(lhb)、雄激素受体(ar)基因的转录表达, 这些转录变化暗示了P4对成年斑马鱼有潜在的弱雄激素效应。此外, P4暴露对雌鱼卵巢和雄鱼精巢类固醇合成途径中固醇激素合成急性调节蛋白(star)、细胞色素p450介导侧链裂解酶(cyp11a1)、17α羟化酶(cyp17)、卵巢细胞色素P450芳香化酶(cyp19a1a)、11β羟化酶(cyp11b)、羟基类固醇3β脱氢酶(hsd3b)、羟基类固醇20β脱氢酶(hsd20b)、羟基类固醇17β脱氢酶3(hsd17b3)、羟基类固醇11β脱氢酶2(hsd11b2)以及受体信号途径中孕激素受体(pgr)、esr1、ar基因的转录表达没有显著影响。可见, 在P4暴露下, 斑马鱼大脑比性腺更加敏感。总而言之, P4能够改变斑马鱼大脑中HPG轴相关基因的转录表达水平, 进而对斑马鱼的内分泌系统具有潜在的危险。     

斑马鱼nr1d4a和nr1d4b基因的表达及其对不同环境刺激的响应

研究获得了斑马鱼nr1d4a和nr1d4b基因的cDNA,进行了序列比对和系统进化分析,并采用实时定量RT-PCR（qPCR）方法研究了其表达模式及对不同环境刺激的转录反应。研究发现,斑马鱼nr1d4a和nr1d4b是由基因复制产生的旁系同源基因,具有高度保守的DNA结合结构域和配体结合结构域。斑马鱼nr1d4a和nr1d4b的表达模式具有明显的差别。nr1d4a在胚胎发育早期的表达量很低,72 hpf时开始显著升高;而nr1d4b具有较高水平的母源性表达,6 hpf时的表达量明显降低,但也在72 hpf显著回升。nr1d4a在脑和肾脏中表达量最高,其次是鳃、卵巢、精巢和眼,在肝脏中的表达量最低;nr1d4b在卵巢中表达量最高,其次是精巢和脑,在肠道和心脏中表达量最低。斑马鱼nr1d4a和nr1d4b都能被多种环境刺激瞬时诱导表达。16℃低温处理0.5h就能显著诱导斑马鱼nr1d4a和nr1d4b基因的表达,但处理6h后其诱导效应开始下降并逐渐消失。除低温外,重金属（2 mol/L镉）、缺氧（5%氧气）和盐度（5）处理均能瞬时诱导nr1d4a和nr1d4b的表达,说明nr1d4a和nr1d4b基因可能参与斑马鱼对多种环境刺激的适应性反应。研究为深入揭示鱼类nr1d4a和nr1d4b基因的生物学功能及其表达调控机制奠定了基础。       

鲤IGF2b基因5''侧翼区序列克隆及不同鲤该区域GC富集区的甲基化分析

鲤(Cyprinus carpio)胰岛素样生长因子2b(insulin-like growth factor 2b,IGF2b)基因为鲤IGF基因家族重要的成员,已有的研究表明5'侧翼区序列对其功能的发挥有重要作用。因此,采用基因组步移法获取5'侧翼区序列,通过亚硫酸盐修饰的方法分析不同品种该区域GC富集区的甲基化状况。本文成功从鲤基因组DNA中获得695 bp的IGF2b 5'侧翼区序列。已获取的IGF2b 5'侧翼区序列经过TFSEARCH分析后发现了多个转录因子结合位点和TATA框,通过BLAST比对发现,鲤IGF2b 5'侧翼区DNA序列与斑马鱼(Danio rerio)IGF2b基因相比,相似性为87%。检测该区域富含GC的序列17个位点,发现建鲤(C.c.var.jian)有2个个体的3个位点出现甲基化,而黄河鲤(C.c.haematopterus)只有1个个体1个位点出现甲基化,这说明2个品种鲤在这个区域出现甲基化修饰的几率低,也验证了这2品种在该基因该区域GC富集区是稳定的。     

建鲤生长激素受体基因分离、转录子多态性以及组织表达特性

使用PCR、RT-PCR和RACE方法分离克隆了建鲤基因组内的4个jlGHRs基因,同源性分析和系统树表明它们两两分属于鱼类GHR1和GHR2,命名为jlGHR1a、jlGHR1b;jlGHR2a、jlGHR2b。jlGHR1s和jlGHR2s的两个旁系同源基因间氨基酸差异分别为5%和11%,但功能保守区FGVFS基序、Box1、Box2基本一致,jlGHR1s和jlGHR2s氨基酸差异为41%。jlGHRs和斑马鱼GHRs基因结构相同,在阅读框内存在7个内含子,两旁系同源基因间内含子长度或序列存在差异。jlGHR1s、jlGHR2s与不同鱼类GHR1、GHR2同源性高低与传统分类地位一致。实验过程中发现建鲤肝脏存在jlGHRs的多种转录子,包括丢失了外显子4的jlGHR1b’、保留了内含子3的jlGHR2a’、丢失了部分外显子8的jlGHR2as。实时定量RT-PCR组织表达结果显示4个jlGHRs在脑、肝、心、头肾、肾、肠、脾、肌肉各组织中均有表达,但表达量差异明显,其中肌肉组织中4个基因表达量均最高,脑中4个基因的表达水平相当,其余各组织中jlGHR2b的表达量均最高。从多转录子和较低表达量推测jlGHR2a所受的选择压力低于jlGHR2b。鲤鱼基因组内分离到GHR1、GHR2的两个旁系同源基因在功能基因方面证实了鲤鱼体内存在两套基因,表明鲤鱼是研究同源基因变异分化的好材料,也为今后正确查找jlGHRs基因上的SNP位点奠定了基础。     

腹腔注射微囊藻毒素-LR对鲢鱼肝脏HO-1和IL-10R1基因表达的影响

本研究首先通过分子生物学方法克隆了鲢鱼血红素加氧酶1(heme oxygenase 1,HO-1)和白细胞介素10受体1(interleukin-10 receptor 1,IL-10R1)2个基因的c DNA片段,然后在腹腔注射微囊藻毒素-LR(microcystin-LR,MC-LR)0.25 h、0.5 h和1 h后的3个时间点进行鲢鱼肝脏样本的采集,并利用荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,q PCR)分析肝脏组织中HO-1和IL-10R1基因表达量的变化。实验结果:(1)克隆得到的鲢鱼HO-1和IL-10R1基因c DNA片段大小分别为133 bp和182 bp,BLAST分析发现鲢鱼HO-1基因c DNA片段与鲤鱼、鲫鱼、斑马鱼的基因序列都有很高的同源性,比例分别为93%、92%、86%;克隆得到的鲢鱼IL-10R1基因c DNA片段与草鱼、鲫鱼和斑马鱼的基因序列的同源性比例分别为98%、91%、81%。(2)q PCR结果显示HO-1基因在注射MC-LR 0.25 h后表达量显著升高,在0.5 h时开始略有下降,在1 h时表达量继续升高。IL-10R1基因表达量在3个时间点均显著升高,并处于持续上升趋势。总结出,在MC-LR的刺激下,HO-1基因被诱导大量合成起到保护细胞的作用,而IL-10R1基因表达量的升高可能会引起IL-10基因发挥功能作用参与炎症及免疫反应,表明HO-1和IL-10R1基因在鲢鱼去MC-LR的过程中都发挥着重要作用,更为进一步研究鲢鱼MC-LR的解毒机制提供了理论依据。     

Cloning of IGF2b 5'Flanking Region and Methylation Analysis of Its GC-rich Sequence in Common Carp (Cyprinus carpio)

鲤(Cyprinus carpio)胰岛素样生长因子2b(insulin-like growth factor 2b,IGF2b)基因为鲤IGF基因家族重要的成员,已有的研究表明5’侧翼区序列对其功能的发挥有重要作用.因此,采用基因组步移法获取5′侧翼区序列,通过亚硫酸盐修饰的方法分析不同品种该区域GC富集区的甲基化状况.本文成功从鲤基因组DNA中获得695 bp的IGF2b 5'侧翼区序列.已获取的IGF2b 5'侧翼区序列经过TFSEARCH分析后发现了多个转录因子结合位点和TATA框,通过BLAST比对发现,鲤IGF2b 5'侧翼区DNA序列与斑马鱼( Danio rerio) IGF2b基因相比,相似性为87％.检测该区域富含GC的序列17个位点,发现建鲤(C.c.var.jian)有2个个体的3个位点出现甲基化,而黄河鲤(C.c.haematopterus)只有1个个体1个位点出现甲基化,这说明2个品种鲤在这个区域出现甲基化修饰的几率低,也验证了这2品种在该基因该区域GC富集区是稳定的.     

过表达miR-9对黄鳝受精卵中基因转录组水平的影响

为了更深入地研究鱼类天然性逆转的生理学机制, 研究通过克隆黄鳝(Monopterus albus) miR-9的前体序列, 及在黄鳝受精卵中过表达miR-9的生物学研究, 最终筛选得到157个基因与miR-9的过表达相关, 其中松弛素信号通路(ko04926)为显著富集的KEGG条目。tektin 4基因(tekt4)、环腺苷酸环化酶合成酶2a(adcy2a)、Ⅰ型细胞骨架角蛋白13(k1c13)和视黄醇脱氢酶5(rdh5)等基因的表达量在miR-9过表达后出现不同程度的升高; 成纤维细胞生长因子13b(fgf13b)和促甲状腺激素释放激素受体2(trhr2)等基因的表达量在miR-9过表达后出现不同程度的降低。rdh5基因在黄鳝眼睛中具有最高的表达水平(P<0.01), 而在脑、血液、精巢和卵巢中几乎没有表达(P<0.01)。松弛素家族基因rln3a和rln3b在黄鳝成鱼中的组织表达模式类似, 均在脑和精巢组织中具有较高的表达水平。推测miR-9可能与黄鳝视觉功能的发育或维持相关; miR-9可能通过松弛素信号通路调控黄鳝精巢的发育过程。研究有助于探讨miR-9对内分泌系统相关基因的调控通路, 为阐明黄鳝性别分化的分子机制提供理论依据。     

普通小麦中Puroindo1ine b-2基因的分子鉴定及表达分析

Puroindoline b-2基因与小麦子粒硬度及其产量密切相关。本研究采用特异引物PCR扩增,荧光定量PCR(RTPCR)方法以及DNA测序技术,对81份国内外小麦品种(系)的Puroindoline b-2不同变异类型进行了分子鉴定,并对Puroindoline b-B2的不同变异类型在子粒、叶片以及根系部位中的表达水平进行了定量分析。结果表明,所有试验材料中的D和A基因组上均含有Pinb-D2v1和Pinb-A2v4类型,而B基因组上的Pinb-B2v3类型在所有材料中所占比例最高,为91.4%;Pinb-B2v2类型比例较低,仅为8.6%。不同变异类型间Pinb-B2基因表达量分析表明,小麦子粒中Pinb-B2v3b的表达量显著高于PinbB2v2变异类型。进一步研究表明,Pinb-B2v3b类型的相对表达量显著高于Pinb-B2v3a和Pinb-B2v3c两种类型,而此2种变异之间无明显差异(Pinb-B2v3c略高于Pinb-B2v3a变异)。不同组织间Pinb-B2基因表达量分析表明,小麦叶片中Pinb-B2的表达量显著高于根系中的表达量。本研究为进一步理解Pinb-2基因分子遗传基础提供了一定的理论依据。     

饥饿及复投喂对金钱鱼肠型脂肪酸结合蛋白基因表达的影响

为阐明肠型脂肪酸结合蛋白基因(ifabp)在金钱鱼(Scatophagus argus)脂肪代谢中的作用, 从金钱鱼肝脏转录组中得到ifabp的unigene片段, 设计特异引物克隆了金钱鱼2种亚型ifabp基因(ssifabp2a和ssifabp2b), 并分析了这2种基因在雌、雄鱼中的组织分布以及饥饿及复投喂后肝脏和肠道中的表达变化。聚类结果表明, ssifabp2a与其他硬骨鱼类Ifabp2a、Ifabp或IfabpX1聚为一类, ssifabp2b则与其他鱼类的Ifabp2b或Ifabp-like聚为一类。同源性比较发现, ssifabp2a与其他硬骨鱼类Ifabp2a、Ifabp或IfabpX1的同源性为78.8%—87.9%; ssifabp2b与其他硬骨鱼类Ifabp2b或Ifabp-like的同源性为79.5%—87.9%; ssifabp2a与ssifabp2b的同源性为73.5%。RT-PCR发现: 在雄鱼中, ssifabp2a在小肠中表达最强, 在肾和肝脏等表达较弱; ssifabp2b也在小肠中表达最强, 在肝脏、胃和下丘脑等较弱。在雌鱼中, ssifabp2a在胃中表达最强, 在肾、肝脏和下丘脑组织表达较弱, 在其他组织中有微弱表达, 脑垂体中没有检测到表达。与ssifabp2a表达情况不同, ssifabp2b在下丘脑、卵巢、心脏、肠中表达较强, 其他组织中有微弱表达, 鳃中没有检测到表达。饥饿及复投喂结果表明: 在肠中, 饥饿2d后, ssifabp2a表达量显著降低, ssifabp2b无显著性变化; 饥饿7d后, ssifabp2a表达量显著下降, 但ssifabp2b无显著性变化; 在复投喂后, 与7d饥饿相比较, ssifabp2a和ssifabp2b的表达量均显著升高。在肝脏中, 饥饿2d后, ssifabp2a表达量无显著变化, 而ssifabp2b的表达量显著升高; 饥饿7d后, ssifabp2a和ssifabp2b的表达量均显著升高; 在复投喂后, ssifabp2a和ssifabp2b表达均显著下降, 恢复到正常水平。结果表明, 饥饿及复投喂对金钱鱼肝脏和肠道中的ssifabp2a和ssifabp2b的表达具有显著影响, 表明两者都参与了金钱鱼的脂肪代谢调节。     

17β-雌二醇对斑马鱼性别分化的影响

有报道表明,经17β-雌二醇(17β-estradiol,E2)处理后,斑马鱼种群中雌性比例上升。为了研究E2雌性化作用的机制,选取一系列斑马鱼体内与性别分化有关的基因(brca2,sox9a,sox9b,dmrt1和cyp19a1a),采用q RT-PCR分析它们在不同的处理条件下表达水平的变化。结果表明,E2能上调雌性相关基因(brca2、sox9b)的表达,下调部分雄性相关基因(sox9a)的表达,对不同发育阶段的斑马鱼体内的性激素转化通路(cyp19a1a)的影响不同。     

黄颡鱼Wnt家族4个基因的克隆、组织表达及对铜的响应

为探究Wnt家族成员在黄颡鱼卵巢发育中的作用, 研究首先采用RT-PCR和RACE技术获取了黄颡鱼Wnt5a、Wnt5b、Wnt7a和Wnt9b基因的全长cDNA序列, 即1984、2905、2158和1622 bp, 其中ORF长度分别为1124、1124、1049和1073 bp, 编码375、375、350和358个氨基酸。氨基酸序列比对和系统树分析显示, 这些基因十分保守, 黄颡鱼WNT与墨西哥丽脂鲤和斑马鱼比较接近。组织表达分析表明, 这些基因的mRNA在脑、脾脏、肾脏、鳃、心脏、肌肉、脂肪、肝脏及卵巢等组织中都有表达, 但表达水平不尽相同。Wnt家族基因对铜的响应研究表明: 在暴露28d时, Wnt7a mRNA水平随着铜浓度先上升后下降, 但是Wnt5a、Wnt5b和Wnt9b基因表达各个处理组无显著性差异; 在56d, Wnt5b在60 μg Cu/L组最低, 其他2个组差异不显著, Wnt9b mRNA水平随着铜浓度先上升后下降, 但是Wnt5a和Wnt7a基因表达各个处理组无显著性差异, 表明Wnt家族这些基因的功能发生了分化, 部分成员介导了铜影响黄颡鱼卵巢发育的调控。研究首次揭示了黄颡鱼Wnt家族部分成员的基因结构和功能, 为深入探讨他们在卵巢发育中的作用奠定了基础。     

Smad2/3a对斑马鱼神经嵴细胞标记基因crestin表达的影响

目的 探讨Smad2/3a对脊椎动物神经嵴细胞发育的影响。方法 通过在斑马鱼胚胎单细胞时期显微注射smad2/3吗啉环修饰的反义寡核苷酸的方法,特异性敲降smad2/3基因的表达,至胚胎发育至6体节,利用整胚原位杂交检测神经嵴细胞特异性标记基因snail1b,sox10,foxd3和crestin的表达情况;通过casmad2 mRNA和smad3a mRNA显微注射的方法过表达smad2和smad3a,同样利用整胚原位杂交检测神经嵴细胞特异性标记基因crestin的表达情况;通过过表达casmad2及smad3a对下调smad2和smad3a的胚胎进行挽救。结果 smad2/3a被敲低后,crestin的表达量显著降低,而snail1b,sox10和foxd3的表达量无明显变化。smad3b被敲低后,crestin,snail1b,sox10和foxd3的表达量均无明显变化;过表达casmad2和smad3a均可导致crestin的表达量增高;过表达casmad2和smad3a可挽救由于smad2/3a敲降所造成crestin的低表达量。结论 Smad2和Smad3a对神经嵴细胞标记基因crestin的表达具有重要作用。     

斑马鱼 HO1 基因的表达特征及功能研究简

实验对血红素加氧酶1(HO1)在斑马鱼发育中的功能进行了研究。多重序列比对结果显示,斑马鱼HO1与哺乳类、鸟类及其他鱼类的HO1氨基酸序列的总体相似性为44.1%—86.8%,血红素结合标签相似性为87.5%—95.8%。对斑马鱼早期胚胎和成鱼各组织进行RT-PCR检测,结果显示HO1转录本母源存在,HO1mRNA的表达水平在尾芽期前较低,到咽囊期迅速上升并稳定在较高水平。HO1基因在斑马鱼成鱼多个组织中均有表达,在肝脏、脾、鳃、肾中的表达量较高。WISH结果显示,HO1基因在斑马鱼胚胎的卵黄合胞层、眼和血液中的表达量较高。利用超表达和基因敲降技术发现,注射HO1 mRNA使HO1基因过表达对斑马鱼早期胚胎发育无明显影响。注射HO1 MO使HO1基因表达抑制可导致斑马鱼胚胎出现发育迟缓、围心腔水肿、尾部消失等不同程度的畸形。HO1 MO导致的斑马鱼胚胎发育异常可被HO1 mRNA回复。利用Real-Time PCR研究发现,HO1基因表达抑制可导致IGF1表达量显著下降,IGFBP1表达量显著升高。这些结果表明斑马鱼HO1基因可通过调节IGF信号途径调控胚胎的正常发育。     

东亚飞蝗fem-1基因的克隆与表达分析

秀丽隐杆线虫Caenorhabditis elegans fem-1基因是性别决定的关键基因。本研究基于生物信息学方法从东亚飞蝗Locusta migratoria manilensis的转录组数据库中克隆出了线虫fem-1的3个同源基因, 将其分别命名为Lmfem-1a, Lmfem-1b和Lmfem-1c (GenBank登录号分别为AB698670, AB698671和AB698672)。其cDNA序列长度分别为2 233, 2 625和2 142 bp, 分别编码662, 642和638个氨基酸。生物信息学分析显示, Lmfem-1a, Lmfem-1b和Lmfem-1c分别含有6, 8和8个典型的锚蛋白重复序列模体。组织表达谱分析发现, Lmfem-1a, Lmfem-1b和Lmfem-1c基因在检测的所有组织中都有表达, 但均在精巢中的表达水平最高, 说明Lmfem-1a, Lmfem-1b和Lmfem-1c基因可能参与东亚飞蝗的多种生理过程, 并受到严格的表达调控。而且, 随着精巢的发育, Lmfem-1a, Lmfem-1b和Lmfem-1c的表达均逐渐增强, 可能与东亚飞蝗的精子形成有关, 但这3个基因是否参与东亚飞蝗的性别决定还有待进一步研究。