黄河裸裂尻鱼细胞色素C氧化酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ亚基基因的克隆及序列特征分析

采用RT-PCR技术克隆获得了黄河裸裂尻鱼(Schizopygopsis pylzovi)CO Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ基因的编码序列,并对此进行了初步分析.结果表明,黄河裸裂尻鱼CO I基因全长为1 551 bp,开放阅读框(ORF)由基因全长组成,编码516个氨基酸;COⅡ基因全长为691 bp,开放阅读框为690 bp,编码2...     

黄河裸裂尻鱼肌肉生长抑制素基因克隆及表达分析

肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)属于转化生长因子β(TGF-β)超家族中的一个成员,是骨骼肌生长发育的负调控因子。该文以黄河裸裂尻鱼肌肉总RNA为模板,采用RT-PCT、5’-RACE和3’-RACE法获得MSTN基因全长cDNA序列为2180bp,包含长为1128bp的开放阅读框,编码375个氨基酸。以肌肉总DNA为模板,通过PCR法进一步获得了MSTN基因的2个内含子序列,分析表明,黄河裸裂尻鱼MSTN基因与其他脊椎动物具有相似的基因结构(包括3个外显子和2个内含子)。黄河裸裂尻鱼MSTN具有脊椎动物MSTN的共同序列特征,含有1个蛋白酶水解位点RXXR和8个位于TGF-β功能区域保守的半胱氨酸残基。氨基酸序列同源性分析表明,黄河裸裂尻鱼MSTN序列与其他鲤科鱼类MSTN具有较高的同源性;而与哺乳动物和禽类的MSTN同源性较低。系统发育分析表明,黄河裸裂尻鱼MSTN与其他鲤科鱼类聚于同一进化支。RT-PCR分析表明,该基因在黄河裸裂尻鱼9个被检组织中均有表达,但在心、肾、肠、精巢中表达量较高。Real-TimePCR分析显示,MSTN基因在胚胎中的相对表达量,随胚胎发育阶段的不同而有所差异,暗示MSTN的功能可能并不局限在对肌肉生长发育的负调控作用,可能还有其他功能。     

黄河裸裂尻鱼肥胖基因克隆及其对青藏高原季节性冷环境的适应性表达

目的克隆黄河裸裂尻鱼肥胖基因(obese gene,ob),分析编码蛋白leptin的序列特征,检测ob mR-NA的组织特异性表达和不同环境温度下肝胰脏和白肌ob mRNA的相对表达水平,为探究黄河裸裂尻鱼在青藏高原季节性寒冷环境下的生态适应机制提供科学数据。方法利用RT-PCT、5’-RACE和3’-RACE法获得ob基因全长cDNA序列。通过已知cDNA序列设计半定量RT-PCR和real-time PCR引物,进行表达研究。结果黄河裸裂尻鱼ob基因序列全长为1 337 bp,其中开放阅读框(ORF)长513 bp,编码170个氨基酸。黄河裸裂尻鱼ob mRNA在心脏、肾脏、脂肪、肠、精巢、肝胰脏、鳃、脑和肌肉9个被检组织中均有表达,其中在心脏中表达最强,肌肉组织中表达最弱。栖息水域环境温度下降,将显著抑制黄河裸裂尻鱼肝胰脏和白肌ob mRNA的表达。结论黄河裸裂尻鱼ob基因特殊的组织表达特征可能与其特定组织的能量代谢及其特殊的生物学功能有关。Leptin在黄河裸裂尻鱼能量代谢调节和季节性环境适应方面发挥着重要作用。     

硬骨鱼类血红蛋白转换表达的新模式——以黄河裸裂尻鱼胚胎型血红蛋白研究为例

为了探讨高原硬骨鱼类胚胎型血红蛋白的转换表达模式, 研究利用转录组数据和克隆方法研究了黄河裸裂尻鱼(Schizopygopsis pylzovi)胚胎型血红蛋白的组成和基因结构, 并通过qRT-PCR和整胚原位杂交方法确定了胚胎发育过程中血红蛋白基因的表达情况。结果表明, 黄河裸裂尻鱼胚胎型血红蛋白基因由hbae1、hbae4、hbbe1和hbbe3组成, 均包含3个外显子和2个内含子, 其中hbbe1/hbae1以“头对头”(3′-5′—5′-3′)转录方式串联在一起, hbbe3/hbae4则以“尾对尾”(5′-3′—3-5′)的转录方式串联在一起。进一步的研究初步判断hbae3、hbae5和hbbe2基因在裂腹鱼亚科鱼类进化过程中可能发生了丢失。qRT-PCR和整胚原位杂交结果均表明在早期胚胎发育过程中4个胚胎型血红蛋白基因的表达都是从受精后第5天(120 hpf)开始明显上升, 但是hbae4和hbbe3基因的高表达只维持在受精后第5天(120 hpf)至破膜期(216 hpf), 随后急剧下降, 而hbae1和hbbe1基因表达从破膜(216 hpf)开始急剧上升。研究揭示了硬骨鱼类一种全新的血红蛋白转换表达模式, 这可能与黄河裸裂尻鱼特殊的进化历程和高原环境的适应有关, 研究结果将为进一步深入研究硬鱼类血红蛋白的时序转换表达和环境适应机制奠定基础。     

花斑裸鲤Epo和Epor基因克隆及其低氧诱导的mRNA表达

促红细胞生成素(EPO)是一种糖蛋白激素,在动物低氧适应中发挥着重要作用。本研究采用RT-PCR方法克隆了花斑裸鲤(Gymncypris eckloni)Epo和Epor基因的编码序列,并开展了分子进化和低氧诱导表达研究。结果表明,花斑裸鲤Epo基因编码序列长度为552 bp,编码183个氨基酸;Epor基因编码序列长度为1 590 bp,编码529个氨基酸。氨基酸序列同源性分析显示,花斑裸鲤促红细胞生成素(EPO)和促红细胞生成素受体(EPOR)与鲤科其他鱼类均有较高的同源性,表明在进化过程中具有较强保守性,同时花斑裸鲤Epo和Epor基因均未经历正向选择。在重度低氧[溶解氧为(0.3±0.1)mg/L]和中度低氧[溶解氧为(3.0±0.1)mg/L]胁迫下,花斑裸鲤部分关键组织如红肌、脑组织中Epo m RNA表达量急剧升高,表明促红细胞生成素(EPO)可能在花斑裸鲤运动、神经营养和神经保护方面发挥了重要作用,是对低氧环境适应的一种调节机制。     

黄河裸裂尻鱼五种群mtDNA控制区的遗传结构

黄河裸裂尻鱼（Schizopygopsis pylzovi）主要分布于青藏高原东北部兰州以上黄河干支流水系和高原北部柴达木内流水系,由于其对高原特殊生境表现出独特的适应性而受研究者关注。本文采用聚合酶链式反应（PCR）和直接测序的方法获得了一个分布于柴达木内流水系种群和四个黄河支流种群共99条个体的线粒体DNA（mtDNA）控制区（D-100p）821bp核苷酸的序列,探讨了其种群遗传结构和分化。99条个体的序列经比对后,发现77个（9．37％）多态性位点,共定义了53个单倍型,其中有一个单倍型（DT12）为两个种群（大通种群和互助种群）所共享,其余52个单倍型均为某个种群所特有。遗传多样性分析表明,柴达木种群的单倍型多样度（h=0．79±0．06）和核苷酸多样度（π=0．0027±0．0017）均略低于黄河支流各种群。AMOVA分析结果显示,遗传差异主要发生在种群之内,占75．39％,而小同水系的种群间只有24．61％,各种群间成对的Fst及遗传距离均表明种群间出现了一定程度的种群分化,但系统进化树最示出一种混杂的单倍型分布格局,提示青藏高原东北部地质事件所造成的水系间的隔离形成较晚。单倍型歧点分布呈现为单峰以及中性检验Tajima的D（-1．497,P=0．058）和Fu的Fs（-24．741,P=0．001）结果综合表明,黄河裸裂尻鱼在青藏高原隆升过程中曾经历过近期的种群扩张事件[动物学报54（6）：972—980,2008]。     

川陕哲罗鲑Cyt b基因克隆及其在鲑亚科中的系统发育关系

采用聚合酶链式反应克隆川陕哲罗鲑Hucho bleekeri线粒体细胞色素b基因 (Cyt b),首次报道该基因的全长序列(1140 bp,GenBank 登录号FJ597623),并与鲑亚科中其他5属14个物种的Cyt b基因进行同源性比较,分析了碱基组成和变异情况,以白鲑亚科的白鲑Coregonus lavaretus作为外群构建了ML、NJ和MP系统发育树.遗传距离和分子系统学分析表明,川陕哲罗鲑与细鳞鲑属的细鳞鱼Brachymystax lenok之间的遗传距离相对较小(8.47%),在系统发育树上两者聚在一起,提示川陕哲罗鲑与细鳞鱼存在较近的亲缘关系,该结果与以往的形态学分类不相符.     

花斑裸鲤红细胞发育相关基因KLF17启动子区域互作蛋白筛选

为了进一步解析鱼类在高原低氧环境下的适应性进化机制,确定相关基因KLF17是否在红细胞发育过程中发挥功能。将高原裂腹鱼亚科鱼类的代表物种——花斑裸鲤(Gymnocypris eckloni)作为实验对象,以实验室前期花斑裸鲤全基因组测序数据为基础,鉴定出红细胞发育相关基因KLF17启动子序列,以其启动子DNA为诱饵,对花斑裸鲤肾脏组织蛋白进行筛选,采用LC-MS/MS技术对候选结合蛋白进行鉴定分析,并进行生物信息学分析。结果表明,在花斑裸鲤肾脏组织中共筛选到576个与KLF17启动子区域特异性结合的蛋白,去除未能鉴定到的蛋白,共有306个候选结合蛋白,其中包括真核翻译起始因子2、细胞色素P450酶、转铁蛋白、含Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶、丙酮酸脱氢酶、红细胞膜蛋白带4.1蛋白等与红细胞或造血相关的蛋白。GO功能富集分析表明,这些候选结合蛋白涉及多种生物学功能,包括参与细胞生长、细胞周期、免疫反应、信号传导、核酸与转录因子结合等过程。KEGG通路分析表明,以上蛋白参与多条信号通路,包括氨基酸代谢通路、细胞凋亡信号通路、PPAR信号通路、Hippo信号通路、细胞色素P45...     

裂腹鱼亚科鱼类Hif-α基因的分子进化及低氧诱导表达

目的 探究低氧诱导因子Hif-α在裂腹鱼亚科鱼类适应低氧环境中的作用及表达调控。方法 利用RT-PCR技术获得了裂腹鱼亚科鱼类13个代表物种的Hif-1αΑ、Hif-1αB、Hif-2αΑ和Hif-2αB基因编码区序列,基于裂腹鱼亚科鱼类系统进化关系开展了基因选择压力分析,并选取花斑裸鲤进行低氧诱导表达研究。结果 Hif-1αΑ、Hif-1αB、Hif-2αΑ和Hif-2αB基因编码区长度分别为2196、2325、2544和2511 bp。通过序列比对发现裂腹鱼亚科鱼类HIF1αΑNODD结构域中保守脯氨酸羟基化基序LxxLAP发生缺失,特化及高度特化的裂腹鱼的HIF1αBCODD结构域中脯氨酸羟基化基序突变为PxxLAP。与常氧组相比,在重度缺氧条件下花斑裸鲤的脑和心脏组织中部分Hif-α基因表达量显著下降,在中度低氧中心脏组织中的Hif-1αA和Hif-2αA基因表达量上调。结论 Hif-α基因在13个物种中受到正向选择作用,但具体物种分支有待进一步研究,同时裂腹鱼亚科鱼类在适应慢性低氧和急性低氧环境可能存在两种不同的表达调控机制。     

花斑裸鲤胚胎/仔鱼型血红蛋白基因家族成员鉴定与时序表达研究

为了探讨花斑裸鲤(Gymnocypris eckloni)血红蛋白时序转换 利用花斑裸鲤全基因组数据鉴定胚胎/仔鱼型血红蛋白基因家族成员, 并通过整胚原位杂交方法, 检测花斑裸鲤胚胎/仔鱼型血红蛋白基因在胚胎发育不同阶段的表达及定位。结果表明, 花斑裸鲤基因组中共鉴定到5个胚胎/仔鱼型血红蛋白基因, 分别为hbae1、hbae4、hbae5、hbbe1和hbbe3, 与斑马鱼(Danio rerio)相比, 花斑裸鲤基因组缺少hbae3和 hbbe2 基因, 暗示第四轮全基因组复制事件后所经历的小规模基因删除事件在花斑裸鲤特异性血红蛋白基因形成中发挥了重要作用。整胚原位杂交结果显示, hbae1基因在胚胎发育的120h至432h内持续表达, hbbe1基因在96h开始表达持续至432h, hbbe3基因杂交信号出现在胚胎发育120h至384h内, 在胚胎发育全过程中未能观察到hbae4和hbae5基因的杂交信号。杂交信号主要位于胚胎正中轴、后部侧向中胚层、背主动脉腹侧区、尾部造血区及卵黄。正义探针作为阴性对照, 在胚胎发育阶段均无任何杂交信号。花斑裸鲤具有与其他鱼类不同的胚胎/仔鱼型血红蛋白基因家族成员及血红蛋白转换表达特征; hbae1、hbbe1和hbbe3基因在花斑裸鲤早期胚胎发育过程中发挥重要作用, 而hbae4和hbae5基因的生物学功能可能有所弱化。