斑马鱼 HO1 基因的表达特征及功能研究简

实验对血红素加氧酶1(HO1)在斑马鱼发育中的功能进行了研究。多重序列比对结果显示,斑马鱼HO1与哺乳类、鸟类及其他鱼类的HO1氨基酸序列的总体相似性为44.1%—86.8%,血红素结合标签相似性为87.5%—95.8%。对斑马鱼早期胚胎和成鱼各组织进行RT-PCR检测,结果显示HO1转录本母源存在,HO1mRNA的表达水平在尾芽期前较低,到咽囊期迅速上升并稳定在较高水平。HO1基因在斑马鱼成鱼多个组织中均有表达,在肝脏、脾、鳃、肾中的表达量较高。WISH结果显示,HO1基因在斑马鱼胚胎的卵黄合胞层、眼和血液中的表达量较高。利用超表达和基因敲降技术发现,注射HO1 mRNA使HO1基因过表达对斑马鱼早期胚胎发育无明显影响。注射HO1 MO使HO1基因表达抑制可导致斑马鱼胚胎出现发育迟缓、围心腔水肿、尾部消失等不同程度的畸形。HO1 MO导致的斑马鱼胚胎发育异常可被HO1 mRNA回复。利用Real-Time PCR研究发现,HO1基因表达抑制可导致IGF1表达量显著下降,IGFBP1表达量显著升高。这些结果表明斑马鱼HO1基因可通过调节IGF信号途径调控胚胎的正常发育。     

血红素加氧酶1在斑马鱼低氧应激中的保护作用研究

实验探讨了低氧条件下血红素加氧酶1（Ho1）对斑马鱼的保护作用。Real-time PCR结果显示，低氧条件下斑马鱼ho1 mRNA水平在斑马鱼胚胎和离体培养细胞ZF4中显著增加，而在成鱼的不同组织中呈现不同的反应。低氧处理24h后，斑马鱼脑、鳃和肝脏中ho1 mRNA表达量明显上升，而在心脏和肾脏中ho1 mRNA表达量显著降低。用锌原卟啉IX（ZnPPIX）抑制ZF4细胞ho1的表达，采用CCK8试剂盒检测细胞存活率，结果显示抑制ho1表达可导致低氧条件下ZF4细胞存活率明显降低。利用Hoechst染色和caspase 3活性检测发现，在低氧条件下抑制ho1表达后ZF4细胞的凋亡率较对照组显著增加，而Ho1的诱导剂可显著降低低氧条件下抑制组的细胞凋亡率。这些结果表明斑马鱼Ho1可能通过抗细胞凋亡发挥低氧保护作用。     

草地贪夜蛾细胞系IPLB—Sf-9酵母双杂交cDNA文库的构建

草地贪夜蛾Spdoptera frugiperda是危害玉米、高粱等农作物的重要害虫.草地贪夜蛾卵巢细胞系IPLB-Sf-9(Sf9)广泛应用于病毒学研究和真核生物基因表达.本研究从Sf9细胞中提取总RNA,应用SMARTTM技术,构建以pGADT7-Rec为载体的sf9细胞酵母GAL4 AD融合cDNA文库.sf9细胞总RNA的电泳谱型与哺乳动物总RNA存在差异,其28S rRNA带弱于18S rRNA带,所合成的原始ds cDNA大小为0.1-4 kb.文库展现良好的多态性,载体质粒插入的cDNA片段大小大部分在0.3-2 kb之间.Sf9细胞酵母GAL4 AD融合cDNA文库的构建为草地贪夜蛾功能基因的识别和鉴定,为研究杆状病毒与宿主细胞的互作机制提供了重要研究工具.     

斑马鱼4个小maf时空表达分析及在调控胰外分泌酶原基因表达中的作用研究

Maf蛋白家族作为重要的转录调控因子,参与细胞众多生命进程。它分为大Maf蛋白和小Maf蛋白,小Maf蛋白需要与其他B-Zip家族蛋白结合形成异二聚体才能发挥作用。在斑马鱼(Danio rerio)中,小Maf包括Mafk、Mafg1、Mafg2和Maft,Mafg1和Mafg2是Mafg在鱼类中特有的分化出的两个旁系同源基因。为了研究这4个小maf在物种之间的进化关系及表达模式,实验对4个小maf进行进化树、染色体线性关系分析,结果显示4个小maf的分子进化方向与物种进化方向一致,mafk和maff在物种间的更趋于保守,mafg比前两者要相对活跃。同时,实验选取斑马鱼胚胎发育十个不同时期(1 cell、2 cells、3.5 hpf、6 hpf、12 hpf、24 hpf、36 hpf、48 hpf、72 hpf、96 hpf),对其表达模式进行了详细的研究,结果显示4个小maf中,mafg2的表达量最高,maft和mafk的表达量次之,mafg1的表达量最低。在胚胎发育的后期(48 hpf),除了mafg2在躯干的血液循环处有明显的表达,maft在躯干的血液循环处有较弱的表达,而除mafk和mafg1在血液循环处没有检测到表达之外,4个基因的表达部位基本重叠,都在全身广泛表达,这可能也与它们之间存在功能叠加和替换有关。利用双荧光素酶检测系统检测了4个小Maf参与调控胰外分泌酶原基因转录的不同功能,结果显示4个小maf的过表达都能使胰外分泌酶原基因的表达下调。研究结果将为深入研究4个小maf基因的功能叠加和互补作用奠定基础。     

斑马鱼胚胎发育过程中TGF-β1基因的表达特征分析

为研究转化生长因子β(Transforming growth factorβ,TGFβ)1对斑马鱼胚胎发育的调控作用,通过NCBI获得TGF-β1基因序列,TGF-β1 cDNA全长1571 bp,编码377个氨基酸。系统进化树分析发现,TGF-β蛋白按照不同的类型严格聚类,斑马鱼TGF-β1与其他鱼类的TGF-β1聚集到一个分支,在进化中非常保守。对斑马鱼胚胎进行RT-PCR和Real-Time PCR检测显示,TGF-β1基因为母源表达基因,在分节期之前的表达水平比较低,而从咽囊期开始持续高水平的表达。胚胎整体原位杂交发现,TGF-β1基因在斑马鱼24 hpf胚胎中开始有特异信号出现,TGF-β1基因的表达主要分布在腮弓、侧线原基、耳囊、嗅觉基板、心脏和前肾等处,表明TGF-β1基因可能参与斑马鱼胚胎免疫调节、循环系统发育和侧线形成。用低氧处理斑马鱼胚胎,发现低氧处理24h后斑马鱼胚胎发育延迟。利用Real-Time PCR和胚胎整体原位杂交检测发现,低氧处理后发育延迟的斑马鱼胚胎中TGF-β1 mRNA表达量较常氧组显著降低。以上结果表明,TGF-β1基因参与斑马鱼胚胎发育调控,并且可能与低氧处理后斑马鱼胚胎发育延迟有关。研究结果将为深入研究斑马鱼TGF-β1基因的功能奠定基础。     

斑马鱼nrf基因时空表达分析及其在调控胰外分泌酶原基因表达中的作用研究

通过GenBank搜索发现,斑马鱼中有6个nrf同源基因,即nfe2、nrf1a、nrf1b、nrf2a、nrf2b和nrf3。为了研究6个nrf在物种之间的关系,实验对6个Nrf蛋白进行系统发育树分析,结果显示6个Nrf蛋白的分子进化趋势与物种进化趋势一致,尽管在硬骨鱼类中由于基因组倍增的原因,nrf1和nrf2基因各产生了两个拷贝,但Nrf蛋白仍然是比较保守的。此外,实验选取斑马鱼胚胎发育十个不同时期（1 cell、2 cell、3.5 hpf、6 hpf、12 hpf、24 hpf、36 hpf、48 hpf、72 hpf、96 hpf）,对其表达模式进行了详细的研究,结果显示:6个nrf在一细胞期都有转录信号,且胚胎发育早期（48 hpf之前）全身广泛表达。72 hpf后,nrf1b、nrf2a、nrf2b、nrf3和nfe2基因的表达部位主要集中在头部、部分躯干、肠处,nrf2b还在脊髓处有微弱的表达。总体来说,6个nrf基因的表达部位基本重叠。研究还利用双荧光素酶检测系统检测了6个Nrf蛋白对胰外分泌酶原基因（tryl）转录的调控,结果显示nrf1a、nrf2a、nrf2b与nfe2的过表达能使tryl的表达上调,而nrf1b与nrf3的过表达能抑制tryl的表达。研究结果将为深入研究斑马鱼6个nrf基因的功能叠加、互补及其功能歧化奠定基础。     

EE2对稀有鮈鲫和斑马鱼幼鱼体内卵黄蛋白原诱导的比较

利用卵黄蛋白原(Vtg)作为类雌激素污染的生物标志物,比较研究了不同浓度的17α-乙炔基雌二醇(EE2)对斑 马鱼(Brachydanio rerio)和稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus)幼鱼体内Vtg的诱导。研究结果表明:5ng/L,20ng/L和100ng/L EE2分别暴露5d后,稀有鮈鲫幼鱼体内的Vtg即可显著诱导,并且其含量随暴露时间的增加而增加,在暴露15d时 达到最大值;而斑马鱼幼鱼虽然100ng/LEE2暴露5d时可显著诱导体内Vtg的生成,但20ng/L EE2在暴露10d后, 5ng/L EE2在暴露15d后,才可显著诱导斑马鱼体内Vtg的生成。这一结果说明EE2暴露下对稀有鮈鲫体内Vtg的 诱导要比斑马鱼敏感。     

稀有鮈鲫生命早期的己烯雌酚暴露对生长发育与繁殖的影响

研究了己烯雌酚(DES)对稀有鲫(Gobiocypris rarus)生命早期暴露的影响。经10μg/L和100μg/L己烯雌酚暴露26d后,稀有鲫死亡率升高,生长发育迟缓,鱼体内卵黄蛋白原(VTG)的诱导明显。经过一段时间清水养殖后,暴露组中雌鱼比例增加,雌雄鱼生长较对照组有显著变化。雌鱼性腺发育及产卵量与对照组相比虽无显著差异,但暴露组成鱼所繁育后代与对照组相比受精率、孵化率显著下降,死亡率、畸形率明显上升。这些结果说明己烯雌酚生命早期暴露影响稀有鲫的生长发育及生殖,稀有鲫生命早期暴露实验可以用于评价水生态系统中内分泌干扰物的生态影响。     

鲫鱼低氧相关基因差减cDNA文库的构建与分析

鲫鱼对低氧具有极强的耐受性。在低氧状态下鲫鱼鳃瓣表面积增加,无氧代谢增强,能量消耗降低。但是人们对鲫鱼产生这些低氧反应的分子机理还缺乏了解。本研究以1%低氧处理24h的鲫鱼囊胚细胞(CAB)作为检测子(Tester),常氧条件下培养的CAB细胞作为驱赶子(Driver),分别提取总RNA,利用SMART cDNA 技术合成双链cDNA,经差减杂交和抑制性PCR扩增获得差减PCR产物。然后将差减PCR产物连接到pGEM-T载体上,构建差减cDNA文库。以管家基因β-actin作为指标检测差减效率,发现该文库差减效率达28倍。随机挑选阳性克隆进行PCR检测,显示差减片段在0.1–2kb之间。挑取含有插入片段的1300个克隆进行测序,通过生物信息学分析获得267个基因序列(e≤0.001;Identity>40%)。该差减cDNA文库的成功构建对克隆鱼类耐低氧相关基因和深入认识鱼类耐受低氧的分子机制有非常重要的意义。